Katalytische Aktivität ist für die Erhöhung der Nanopartikeldosis in der Photonen- und Protonentherapie unerlässlich

Nature Communications Band 13, Artikelnummer: 3248 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Die auf Nanopartikeln basierende Strahlenverstärkung ist eine vielversprechende Strategie zur Erweiterung des therapeutischen Verhältnisses der Strahlentherapie. Während die (prä)klinischen Ergebnisse ermutigend sind, muss noch ein fundiertes mechanistisches Verständnis der Radioverstärkung durch Nanopartikel, insbesondere der Auswirkungen der Nanomaterialauswahl und der Bestrahlungsbedingungen, erreicht werden. Hier untersuchen wir die Strahlenverstärkungsmechanismen ausgewählter Metalloxid-Nanomaterialien (einschließlich SiO2, TiO2, WO3 und HfO2), TiN- und Au-Nanopartikel für die Strahlentherapie unter Verwendung von Photonen (150 kVp und 6 MV) und 100 MeV-Protonen. Während Au-Nanopartikel in kV-Bestrahlungsumgebungen, in denen der photoelektrische Effekt vorherrscht, hervorragende Strahlenverstärkungseigenschaften aufweisen, werden diese Eigenschaften für eine klinisch relevantere Bestrahlung mit MV-Photonen und Protonen auf das Grundniveau abgeschwächt. Im Gegensatz dazu behalten HfO2-Nanopartikel einen Teil ihrer Strahlenverstärkungseigenschaften bei MV-Photonen- und Protonentherapien. Interessanterweise zeigen TiO2-Nanopartikel, die eine vergleichsweise niedrige effektive Ordnungszahl haben, bei allen drei Bestrahlungseinstellungen eine signifikante Strahlenverstärkungseffizienz, was auf die starke radiokatalytische Aktivität von TiO2 zurückzuführen ist, die zur Bildung von Hydroxylradikalen und nuklearen Wechselwirkungen mit Protonen führt. Zusammengenommen ermöglichen unsere Daten die Extraktion allgemeiner Designkriterien für Nanopartikel-Radioverstärker für verschiedene Behandlungsmodalitäten und ebnen so den Weg zu leistungsoptimierten Nanotherapeutika für die Präzisionsstrahlentherapie.

Die Strahlentherapie ist ein integraler Bestandteil der Krebsbehandlung und wird bei mindestens 50 % aller Krebspatienten angewendet1,2. Diese Behandlungsmethode weist eine geringe Gewebespezifität auf und trotz erheblicher Fortschritte bei der Dosisabgabe erhalten gesunde Gewebe in der Nähe des Zielvolumens normalerweise unerwünschte Strahlendosen, was möglicherweise zu erheblichen Nebenwirkungen führt3. Im Allgemeinen bestimmt die Eindämmung der späten Toxizität für gesundes Gewebe die maximale Dosis, die während der Strahlentherapie an den Tumor abgegeben werden kann. Um die oben genannten Einschränkungen zu überwinden und das therapeutische Verhältnis zu erhöhen, bieten Nanopartikel einen vielversprechenden Weg zur gezielten Strahlentherapie, indem sie als Strahlenverstärker wirken4. Im Tumorgewebe eingelagerte Nanopartikel erhöhen selektiv den Strahlungsabsorptionsquerschnitt im Vergleich zu dem der gesunden Gewebeumgebung5. Die Wirkung ionisierender Strahlung auf biologische Strukturen wird durch physikalische, chemische und biologische Phänomene bestimmt6,7. Die genauen Beiträge von Nanopartikeln und insbesondere ihre Materialzusammensetzung während dieser Stadien und innerhalb einer zellulären Umgebung während der Bestrahlung müssen noch verstanden werden. Das derzeitige mechanistische Verständnis wird insbesondere durch das Fehlen grundlegender und vergleichender Studien4,8 erschwert, was ein rationales Design von Nanopartikel-Radioverstärkern ausschließt.

Betrachtet man nur die physikalische Dosiserhöhung, sind Nanopartikel mit hohem Z eine natürliche Wahl, da ihr photoelektrischer Absorptionsquerschnitt, der ungefähr mit Z4 skaliert, deutlich höher ist als der von Weichgewebe oder Wasser9. Allerdings hängt der photoelektrische Gewebekontrast auch stark von der Energie der einfallenden Photonen ab (~E−3). Daher und im Gegensatz zu kV-Röntgenstrahlen wäre bei höheren Energien (MV-Röntgenstrahlen) nur eine begrenzte Dosissteigerung zu erwarten9,10. Tatsächlich werden physikalische Wechselwirkungen bei Energien über 500 keV von Compton-Streuereignissen dominiert, deren Wirkungsquerschnitte linear proportional zu Z11 sind. Daher wurde vermutet, dass chemische und biologische Effekte eine entscheidende Rolle bei der Erhöhung der Nanopartikeldosis spielen, die in vitro und in vivo mit MV-Photonen gefunden wird7,9,12. Es gibt zunehmend experimentelle und klinische Belege für eine Verbesserung der Sicherheit und Wirksamkeit der nanopartikelbasierten Strahlentherapie sowohl für kV- als auch für MV-Photonen8,13,14,15,16. Vor allem HfO2-Nanopartikel, die von Nanobiotix als NBTXR3/Hensify® vermarktet werden, haben kürzlich die Zulassung für den europäischen Markt erhalten16. Diese HfO2-Nanopartikel erhielten im April 2019 die europäische CE-Kennzeichnung für die Behandlung von lokal fortgeschrittenen Weichteilsarkomen durch intratumorale Injektion mit Photonenstrahlentherapie und werden für die Behandlung anderer Krebsarten untersucht17.

Während überraschend wenig über die Mechanismen der Strahlenverstärkung durch Nanopartikel mit klinischen MV-Photonenstrahlen bekannt ist, wurde die Dosisverstärkung durch Nanopartikel mithilfe von Protonen noch weniger untersucht. Protonen können auch als Alternative zu Photonen bei der Behandlung von Krebserkrankungen eingesetzt werden und weisen eine bessere Dosisanpassung auf. Als positiv geladene subatomare Teilchen interagieren Protonen anders mit Materie, was zu einem deutlich anderen Dosis-Tiefen-Profil führt als ungeladene Photonen18,19. Während die Dosisabgabe der Photonen in der Tiefe kontinuierlich erfolgt und über den Tumor hinausgeht, was zu einer „Austrittsdosis“ führt, verlieren Protonen im Bereich des Bragg-Peaks den Großteil ihrer Energie und werden danach vollständig gestoppt19. In der Bragg-Peak-Region werden Protonen abgebremst, was zu einer Erhöhung der Wechselwirkungswahrscheinlichkeit mit Orbitalelektronen und der Anzahl von Ionisationsereignissen im Gewebe führt. Schließlich wird das Proton in einem Ladungsänderungsprozess absorbiert18. Die Position des Bragg-Peaks kann an die Lage und Größe des Tumorvolumens angepasst werden, um die an das umgebende Gewebe abgegebene Dosis zu minimieren19. Im Hinblick auf die Verbesserung der Nanopartikel-Protonentherapie haben mehrere Monte-Carlo-Studien den Einfluss der Protonenenergie20, der Nanopartikelgröße und -beschichtung21 oder der Nanopartikel-Clusterbildung22 auf die durch Au-Nanopartikel vermittelte Dosiserhöhung untersucht. Darüber hinaus wurden In-vitro-Studien zur Dosiserhöhung für Au-Nanopartikel durchgeführt, die mit Protonenbestrahlung verwendet wurden, was auf Dosiserhöhungen im Bereich von 0–44 % hinweist23,24,25,26,27. Darüber hinaus wurden Fe-basierte oder Au-Nanopartikel in Kombination mit Protonenbestrahlung erfolgreich eingesetzt, um in vivo eine vollständige Tumorremission zu erreichen28.

Während die oben genannten Studien allgemein vielversprechende Ergebnisse für die Dosissteigerung durch Nanopartikel zeigen, deuten sie auch auf eine starke Abhängigkeit von der Zusammensetzung des Nanomaterials und der Art der Bestrahlung hin. Darauf deuten auch die Erkenntnisse von Smith et al. hin. (2015), der die Dosiserhöhung durch Au-Nanopartikel während der Röntgenbestrahlung (kV und MV) und der Protonenbestrahlung in Alanin-Elektronen-Paramagnetischen-Resonanz-Dosimetern (EPR) verglich und eine etwa 60 %ige Verbesserung für kV, 10 % für MV und 5 % zeigte. für Protonenbestrahlung29. Trotz einzelner Erfolge, einschließlich der klinischen Verwendung von HfO2-Nanopartikeln, fehlt uns ein mechanistisches Verständnis und wir scheitern daher daran, Nanopartikelmaterialien für eine optimale Dosiserhöhung unter verschiedenen Bestrahlungseinstellungen (Photonen, Protonen) auf evidenzbasierte Weise auszuwählen.

Hier präsentieren wir eine konzeptionelle Untersuchung, die die Hauptfaktoren für die Erhöhung der Nanopartikeldosis als Funktion der Nanomaterialzusammensetzung und der Strahleigenschaften entwirrt. Wir haben ein Portfolio von Nanopartikeln aus verschiedenen Kernmaterialien (einschließlich TiN, TiO2, WO3 und HfO2 sowie Au und SiO2 als kommerziell erhältliche Referenzmaterialien) synthetisiert und ihre physikalischen, chemischen und biologischen Fähigkeiten zur Dosissteigerung in konsistenten Umgebungen bewertet wobei beobachtete Unterschiede direkt auf Nanomaterialeigenschaften als einzige Variable im System zurückgeführt werden können. Wir zeigen, dass Au-Nanopartikel bei kV-Bestrahlungseinstellungen eine hervorragende Dosissteigerung zeigen, die bei MV-Photonen- und Protonentherapieeinstellungen fast vollständig verschwindet. Im Gegensatz dazu behalten HfO2-Nanopartikel bei der MV-Strahlentherapie eine gewisse Fähigkeit zur Dosissteigerung bei, wenn auch im Vergleich zu kV-Bestrahlungen stark reduziert. Am interessantesten ist, dass katalytisch aktive TiO2-Nanopartikel ihre dosissteigernde Wirkung in allen drei Bestrahlungseinstellungen beibehalten.

Abbildung 1 zeigt Transmissionselektronenmikroskopbilder (TEM) der durch Flammensprühpyrolyse (FSP) synthetisierten (TiO2, TiN, WO3, HfO2) und kommerziell erhältlichen (SiO2, Au) Nanopartikel, die für Radioverstärkungsuntersuchungen verwendet werden. Primärpartikel hatten eine sphärische Morphologie, mit Ausnahme von TiN und WO3, die leicht elliptische Formen aufwiesen. Die mittleren Primärpartikeldurchmesser basierend auf TEM-Bildern (dTEM) betrugen ~5 nm für TiO2 und HfO2, 10–15 nm für WO3 und TiN und 50 nm für Au-Nanopartikel (Tabelle 1).

Repräsentative TEM-Bilder (insgesamt mehr als 200 Nanopartikel und mindestens fünf Bereiche der Probe, die für jeden Partikeltyp analysiert wurden) von kommerziell erhältlichen SiO2- (a, A380, Evonik Industries AG, Deutschland), FSP-synthetisierten Metalloxid- oder Nitrid-Nanopartikeln (b–e ) und kommerziell erhältliche 50 nm große Au-Nanopartikel (f).

Die aus XRD-Messungen erhaltenen Kristallgrößen (dXRD) stimmten alle mit den in TEM-Studien gefundenen Werten für den Primärpartikeldurchmesser überein (dTEM, Tabelle 1). Stickstoffadsorptionsmessungen (BET) ergaben spezifische Oberflächen (SSAs) und Partikelgrößen (dBET), die wiederum gut mit den Primärpartikelgrößen dXRD und dTEM übereinstimmten, was nur auf eine begrenzte Sinterhalsbildung oder Partikelaggregation hinweist (Tabelle 1). ). Die hydrodynamischen Durchmesser (Z-Durchschnitt) aller flammengefertigten Nanopartikel in Wasser waren mit Werten zwischen 100 und 130 nm vergleichbar (Tabelle 1). Die Citrat-stabilisierten Au-Nanopartikel zeigten einen Z-Durchschnitt nahe ihrer Primärpartikelgröße und vergleichbar mit denen der FSP-synthetisierten Nanopartikel. Organische Rückstände auf der Nanopartikeloberfläche, die aus der Nanopartikelsynthese stammen, wurden mittels thermogravimetrischer Analyse (TGA) geschätzt. Alle Nanopartikel wiesen Oberflächenrückstände von ≤2 Gew.-% (Gewichtsprozent) auf. Lediglich TiO2 wies organische Gehalte von bis zu 4 Gew.-% auf, die durch Nachglühen weiter reduziert werden konnten. Alle Partikeltypen waren in Wasser gut dispergierbar.

Alle Oxid-Nanopartikel wurden im Allgemeinen von menschlichen Sarkomzellen (HT1080) gut vertragen. Scheinbestrahlungsexperimente (0 Gy) ergaben tödliche LC50-Werte deutlich über 160 µg/ml für alle Nanopartikel und Expositionszeiten von 5 Tagen, mit Ausnahme von TiN, wo der LC50-Wert 157 µg/ml betrug (ergänzende Abbildung 1). Die zelluläre Aufnahme der oben genannten Nanopartikel wurde mittels Elektronenmikroskopie und Elementaranalyse untersucht. Abbildung 2 zeigt rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von HT1080-Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit den angegebenen Nanopartikeln. Nanopartikel wurden von Zellen aufgenommen, höchstwahrscheinlich über einen endozytischen Weg30, und bildeten intrazytoplasmatische Agglomerate, was gut mit früheren Studien zu flammengefertigten Nanopartikeln übereinstimmt31. Im Zellzytoplasma (in Vesikeln oder Endosomen) waren wenige hundert Nanometer bis Mikrometer große Nanopartikel-Agglomerate verteilt. In den mehr als 100 Zellen, die pro Nanopartikeltyp analysiert wurden, wurden keine Hinweise auf eine Aufnahme von Nanopartikeln in den Zellkern gefunden, obwohl die Aufnahme insgesamt und die Anreicherung von Nanopartikeln im Zellkern möglicherweise vom Partikel- und Zelltyp abhängig sind32,33. Die Aufnahme von Nanopartikeln war für alle Arten von Oxiden vergleichbar, mit Ausnahme von WO3-Nanopartikeln, bei denen nur sehr wenige Nanopartikel-Agglomerate intrazellulär gefunden wurden (Abb. 2d).

Rastertransmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen (STEM) von HT1080-Zellen, die 24 Stunden lang 80 µg/ml SiO2 (a), TiO2 (b), TiN (c), WO3 (d), HfO2 (e) und Au (f) Nanopartikeln ausgesetzt wurden . Intrazelluläre und zellassoziierte Metallmasse, normalisiert auf die Zellzahl, quantifiziert durch ICP-MS (g). Daten in g, ausgedrückt als Mittelwert ± SD aus n = 4 biologischen Wiederholungen pro Datenpunkt, untersucht über 2 unabhängige ICP-Experimente.

Zur Quantifizierung der auf die Zellzahl normierten Metallmasse wurde eine Elementaranalyse auf Basis der Massenspektrometrie mit induktiv gekoppeltem Plasma (ICP MS) eingesetzt. Bei Nanopartikelkonzentrationen von 80–160 µg/ml wurde für die meisten Partikel eine Aufnahme von ~1 ng Metallmasse pro HT1080-Zelle festgestellt. ICP-MS-Ergebnisse bestätigten die Beobachtungen aus TEM-Bildern und zeigten, dass die intrazellulären Metallkonzentrationen für Wolfram zwei Größenordnungen niedriger waren als für alle anderen Metalle (Abb. 2g und ergänzende Abb. 2). Zusätzliche Untersuchungen bestätigten die Auflösung von WO3-Nanopartikeln unter sauren, Lysosomen-ähnlichen Bedingungen (ergänzende Abbildung 3).

Nach der physikalisch-chemischen Charakterisierung der synthetisierten Nanopartikel-Radioverstärkerkandidaten und Studien zur zellulären Aufnahme führten wir Monte-Carlo-Simulationen mit TOPAS/Geant4 durch, um den Beitrag abzuschätzen, der von der physikalischen Dosiserhöhung als Funktion des Kernmaterials und der Art der Bestrahlung zu erwarten ist (150). kVp-Photonen, 6 MV-Photonen oder 100 MeV-Protonen). Wir untersuchten die Dosisablagerung innerhalb und um ein einzelnes, mit Nanopartikeln gefülltes Vesikel sowie im Zytoplasma und Zellkern einer einzelnen Zelle. Wir extrahierten physikalische Dosiserhöhungsfaktoren (DEFs), indem wir das Verhältnis der erzielten Dosis zum Zytoplasma, Zellkern, Vesikel bzw. Wasserhüllen in Gegenwart der Nanopartikel zu der Dosis ohne Nanopartikel (Wasser) ermittelten. Die Geometrien wurden so konstruiert, dass sie den zellulären Aufnahmeszenarien möglichst genau entsprechen, wobei Nanopartikel-Agglomerate von ca. 400 nm nur im Zytosol verteilt sind (siehe auch Abb. 2)31. Da die Aufnahme von Nanopartikeln in den Kern experimentell nicht beobachtet wurde, wurde sie auch für die Simulationen als vernachlässigbar angesehen.

Die Erhöhung der nanoskopischen Dosis ergibt sich aus der Sekundärelektronenemission nach der Ionisierung eines Nanopartikels, wobei Auger-Elektronen zur Verbesserung der Reichweite im niedrigen Bereich (~10 nm) und Elektronen höherer Energie (Photo- oder Compton-Elektronen) zur Verbesserung der Reichweite im Mikrometerbereich beitragen34,35. Abbildung 3a, b zeigen die simulierten Dosissteigerungen für verschiedene Nanopartikel in einem mit Nanopartikeln gefüllten Vesikel mit einem Radius von 200 nm und innerhalb von 50 nm großen Wasserhüllen, die das Vesikel umgeben. Ein DEF-Wert > 1 deutete auf eine zusätzliche Dosisdeposition durch Nanopartikel im Vergleich zu Wasser hin, während ein DEF-Wert von 1 bedeutete, dass keine zusätzliche Dosisdeposition beobachtet wurde. Bei Röntgenstrahlen mit niedrigerer Energie (150-kVp-Quelle) wurden die höchste Dosisabscheidung und ein deutlicher Einfluss der Ordnungszahl beobachtet. Dies steht im Einklang mit den unterschiedlichen Massenenergieabsorptionsquerschnitten, die durch den photoelektrischen Effekt für Metalle mit hohem Z verursacht werden. Die Dosiserhöhungsfaktoren innerhalb eines mit Nanopartikeln gefüllten Vesikels erreichten Werte von DEF = 30–40 für Au-Nanopartikel und DEF = 10–20 für HfO2- und WO3-Nanopartikel beim höchsten erreichten Nanopartikelgehalt von 32,4 Vol.-% (Volumenprozent) im Vesikel (Abb. 3a). Dieser Packungsanteil ist auch für biologische Szenarien sinnvoll. Beispielsweise wurden Nanopartikel-Volumenanteile von 35 ± 16 % pro Vesikel in Zellen für 30 nm große Au-Nanopartikel36 und ähnliche Expositionsbedingungen wie in unserer Studie berichtet. Low-Z-Nanopartikel wie TiO2, TiN und SiO2 zeigten überhaupt keinen nanoskopischen Dosisanstieg. Der Dosiserhöhungsabfall von der gefüllten Vesikeloberfläche folgte einem 1/r-Typ-Abfall, und der DEF konvergierte innerhalb eines Mikrometers des Zytoplasmas auf DEF = 1 (Abb. 3b). Bei MV-Röntgenstrahlen wurde eine Dosiserhöhung innerhalb und um mit Nanopartikeln gefüllte Vesikel nur für Au-Nanopartikel festgestellt (ergänzende Abbildung 4). Es wurde festgestellt, dass diese Verstärkung noch stärker lokalisiert war und innerhalb von 100 nm von der Vesikeloberfläche auf DEF = 1 konvergierte. Die nanoskopische physikalische Verstärkung der Protonenbestrahlung war für alle Nanopartikel vernachlässigbar (ergänzende Abbildung 4b).

DEF in einem 400-nm-Wasservesikel, gefüllt mit unterschiedlichen Mengen an Nanopartikeln, bei Bestrahlung mit 150-kVp-Röntgenstrahlen (a). DEF in 100-nm-Hüllen um ein 400 nm großes Nanopartikel gefüllt mit 166 (=32,4 Vol.-%) Nanopartikeln bei Bestrahlung mit 150-kVp-Röntgenstrahlen (b). Schematische Darstellung des Zellmodells bestehend aus einem zentralen Zellkern und mit Nanopartikeln gefüllten Vesikeln im Zytoplasma (keine Nanopartikel im Zellkern) und des Partikeleinflusses für die verschiedenen verwendeten Photonen- und Protonenstrahlquellen (c). DEF im Zytoplasma und Kern für 150-kVp-Röntgenstrahlen (d), 6-MV-Röntgenstrahlen (e) und 100-MeV-Protonen (f). Daten in a, b und d–f angegeben als Mittelwert ± SD aus n = 3 Simulationsexperimenten. Quelldaten werden als Quelldatendatei bereitgestellt.

Der Gesamt-DEF im Zytoplasma oder Kern stieg linear mit zunehmender Nanopartikelfüllung. Dies steht im Einklang mit der Berechnung des makroskopischen DEF

wobei fZ der Massenanteil der Ordnungszahl (Z) im System ist und \({{{{{\rm{\mu }}}}}}}_{{{{{{\rm{en}}}} }}}({E})/{\rho }\) der Massenenergieabsorptionskoeffizient bei einer monoenergetischen Photonenenergie, E37. Masse und Volumenanteil (fVol) hängen über ein konstantes Dichteverhältnis der Materialien zusammen. Wir haben daher eine lineare Anpassung verwendet, um die Dosiserhöhungseffizienz eines Nanopartikels (NP) pro zellulärem Nanopartikel-Volumenanteil zu beschreiben, \({{{{{{\rm{\chi }}}}}}}_{{{{ {{\rm{NP}}}}}}}\), innerhalb des Zytoplasmas und des Zellkerns, mit der Beziehung \({{\chi }}_{{{{{{\rm{NP}}}}}} }=({{{{{\rm{DEF}}}}}}-1)/{{f}}_{{{{{\rm{Vol}}}}}},{{{{{ \rm{NP}}}}}}}\) (Ergänzende Abbildung 5).

Es ist offensichtlich, dass für Au, HfO2 und WO3 erhebliche zusätzliche Dosen im Zytoplasma und im Zellkern deponiert wurden, jedoch nur bei kV-Energien. Im Zytoplasma erreichte der DEF Werte von etwa 10,5, 5,0 und 3,7, während er im Zellkern 5,7, 2,9 bzw. 2,3 Prozent Au, HfO2 bzw. WO3 pro Nanopartikel-Volumenanteil erreichte. Bei Verwendung des 6-MV-Röntgenspektrums wurde die Dosissteigerungseffizienz pro Nanopartikel-Volumenanteil im Vergleich zur 150-kVp-Quelle etwa um das Zehnfache verringert. Wir fanden DEF-Werte von 1,9 und 1,4 für Au, 1,3 und 1,2 für HfO2 und 1,2 und 1,1 für WO3-Nanopartikel pro Volumenprozent im Zytoplasma bzw. Zellkern. Bei Low-Z-Nanopartikeln wie TiO2, TiN oder SiO2 wurde keine physikalische Nanopartikelverstärkung festgestellt, da bei keiner Art von Strahlungsquelle eine erhebliche zusätzliche Dosis im Zytoplasma, im Zellkern oder im mit Nanopartikeln gefüllten Vesikel deponiert wurde. Für keines der untersuchten Nanopartikel wurden für die Protonenstrahlquelle (DEF = 1) dosissteigernde Effekte festgestellt.

Während in der Literatur keine umfassende Studie verfügbar ist, sind Daten für Au-Nanopartikel von Rudek et al. verfügbar. für ein vergleichbares Zellmodell. Sie berichteten über DEFs von 2 bzw. 3,5 im Zellkern und im Zytoplasma für monoenergetische Röntgenstrahlen mit 100 kV und 5 Gew.-% zufällig verteilter Au-Nanopartikel38. In unserer Studie lagen diese Werte bei 2,2 (Kern) und 3,5 (Zytoplasma) für 0,26 Vol.-% Au, was 5 Gew.-% Au entspricht, und stimmen daher gut mit ihren Daten überein. Darüber hinaus stimmen wir ihrer Feststellung zu, dass die Erhöhung der intrazellulären physikalischen Dosis für Protonen eher vernachlässigbar ist.

Lokal verstärkte physikalische Dosiseffekte und eine erhöhte Ionisierung sauerstoffhaltiger Moleküle in der Nähe des Nanopartikels können zur Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)1,9 führen. Darüber hinaus können katalytische Reaktionen auf der Nanopartikeloberfläche zu einer verstärkten Radiolyse und ROS-Bildung führen, indem sie die Ionisierungspotentiale von Molekülen an der Nanopartikel-Flüssigkeits-Grenzfläche senken oder durch Elektronendonorprozesse1,39. Auf diese Weise können auch Elektronen mit niedrigeren Energien als typischerweise erforderlich zur Wasserionisierung führen. Wir untersuchten daher die verstärkte ROS-Erzeugung durch Nanopartikel unter Bestrahlung mithilfe des bekannten 2′,7′-Dichlordihydrofluoresceindiacetat-Assays (H2DCF-DA). Dieser Assay weist eine der höchsten Reaktivitäten unter den etablierten ROS-Assays für erzeugte •OH-Radikale auf und ist daher eine sinnvolle Wahl für die Quantifizierung von ROS40. Während SiO2- und TiN-Nanopartikel keinen Anstieg der ROS-Bildung zeigten (DEFROS ~ 1), zeigten TiO2-, WO3- und HfO2-Nanopartikel bei allen Arten ionisierender Strahlung eine erhöhte ROS-Bildung mit zunehmender Partikelkonzentration (DEFROS > 1) (Abb. 4). Die ROS-Bildung unter Röntgenbestrahlung war im Allgemeinen höher als unter Protonenbestrahlung (Abb. 4c – e). Die Anpassung einer linearen Regression für die ROS-Verstärkung gegenüber der Oberflächenkonzentration der Nanopartikel ergab ROS-Verstärkungseffizienzen, die in den Reihenfolgen WO3 > TiO2 > HfO2 unter kV-Röntgenbestrahlung und TiO2, WO3 > HfO2 unter MV-Röntgen- und Protonenbestrahlung abnahmen (Abb . 4f).

Chemische Dosiserhöhungsfaktoren (DEFROS) für SiO2 (a), TiO2 (b), TiN (c), WO3 (d) und HfO2 (e), bewertet mit dem azellulären H2DCF-DA-Assay unter 150 kVp und 6 MV Photon sowie 100 MeV Protonenbestrahlung. Die exponierten Nanopartikeloberflächen wurden konstant gehalten (36,8, 368 und 1840 cm2/ml), wodurch sich für jedes Nanopartikel unterschiedliche Volumen- oder Metallmassenkonzentrationen (x-Achsen) ergaben. Daten in a–e ausgedrückt als Mittelwert ± SD für n = 6 Proben, die über 2 unabhängige DCF-Experimente untersucht wurden. Gerade und gepunktete Linien zeigen die Steigungs- bzw. 95-%-Konfidenzniveau-Vorhersagegrenzen der linearen Anpassung. Balken und Fehlerbalken in f stellen die Steigungen und das 95 %-Konfidenzintervall der linearen Regressionsantwort für DEFROS pro Oberflächenkonzentration jedes Nanopartikels und für jede Bestrahlungsbedingung dar (n = 18 Probenpunkte pro Regression).

Bei diesen Messungen zur Erhöhung der chemischen Dosis lag der Gesamtmetallgehalt bei allen getesteten Nanopartikelkonzentrationen unter 0,3 Gew.-% oder unter 0,05 Vol.-%. Bei solch niedrigen Prozentsätzen ist die physikalische Dosiserhöhung vernachlässigbar, insbesondere für andere Nanopartikel als Au und für MV-Röntgenstrahlen oder Protonen (DEF <1,2, siehe Abb. 3d – f). Die ROS-Dosiserhöhung (DEFROS) war mindestens 10–100-mal höher als der physikalische Dosiserhöhungseffekt pro Nanopartikel-Volumenprozent (ergänzende Abbildung 5). Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die in diesem Test beobachteten Nanopartikeleffekte hauptsächlich auf katalytischen Oberflächeneffekten beruhten. Um Auswirkungen synthesebedingter organischer Rückstände auf der Oberfläche von TiO2-Nanopartikeln auszuschließen (Tabelle 1), führten wir eine Temperstudie mit Temperaturen von bis zu 500 °C durch, um solche Rückstände zu entfernen. DEFROS blieb durch das Tempern unbeeinflusst (ergänzende Abbildung 6), und wir kamen daher zu dem Schluss, dass organische Oberflächenrückstände in unserer Umgebung keinen messbaren Einfluss auf die ROS-Erzeugung unter Bestrahlung hatten.

Zur Erklärung der chemischen Verstärkung wurden bereits früher katalytische Prozesse postuliert, die um mehrere Größenordnungen (z. B. bis zum 2000-fachen)41 höher waren als das, was man von rein absorptionsbedingten Prozessen während der Bestrahlung von Nanopartikelsuspensionen erwarten konnte39,41. Ein solcher vorgeschlagener katalytischer Mechanismus beinhaltet die Bildung einer strukturierten Wasserschicht um Nanopartikel, die zu einer Schwächung der H-OH-Bindungen und damit zu einer effizienteren Wasserradiolyse in der Nähe von Nanopartikeln führt39. Ein solcher Mechanismus wäre unabhängig vom Nanopartikelmaterial. In unserer Studie hing die ROS-Verstärkung bei vergleichbaren Oberflächenexpositionen von der Materialzusammensetzung ab, was darauf hindeutet, dass der vorliegende katalytische Prozess eher einen Ladungsübertragungsprozess beinhaltet, der für die Nanopartikelzusammensetzung spezifisch ist. Es wurde gezeigt, dass Halbleiterpartikel mit oder ohne Bandlückentechnik über photokatalytische Eigenschaften verfügen, die beispielsweise zur Zersetzung organischer Moleküle wie Methylenblau oder Ethylen genutzt werden können42,43,44. Es wird angenommen, dass TiO2 und WO3 aufgrund der relativen Position ihrer Ladungs- und Valenzbandpotentiale besonders wirksam für die Produktion von •OH-Radikalen und den Photoabbau organischer Moleküle sind45. Daher kamen wir zu dem Schluss, dass die ROS-Erzeugung mit TiO2 und WO3 aufgrund ihrer günstigeren Energiebandpotentiale der mit HfO2-Nanopartikeln bei allen Bestrahlungsbedingungen (kV/MV-Photonen und Protonen) überlegen war.

Bei HfO2-Nanopartikeln wurde ein deutlicher Einfluss des Strahlungstyps auf die ROS-Verstärkung beobachtet, wobei die Verstärkungsverhältnisse für (MeV-Protonen):(MV-Röntgenstrahlen):(kV-Röntgenstrahlen) ungefähr 1:2:4 skalierten (Abb. 4e). , F). Die unterschiedlichen katalytischen Effizienzen für kV- und MV-Röntgenstrahlen könnten mit höheren Absorptionsquerschnitten bei kV-Energien zusammenhängen, was auch auf eine höhere Anregungswahrscheinlichkeit bei solchen Energien schließen lässt. Die Anregung von Nanopartikeln, die zur Erzeugung von Elektron-Loch-Paaren führt, ist der grundlegende Prozess hinter photokatalytischen Oberflächenreaktionen46. Wir kamen daher zu dem Schluss, dass (i) Protonenbestrahlung im Vergleich zu Röntgenstrahlen zu einer geringeren Nanopartikelanregung führte und (ii) das Energiespektrum (150 kVp gegenüber 6 MV) der Röntgenstrahlen einen Einfluss auf die Erzeugung von Elektron-Loch-Paaren hatte für High-Z-Nanopartikel (HfO2 und WO3), jedoch nicht für TiO2-Nanopartikel. Au-Nanopartikel besitzen auch die Fähigkeit, ROS unter Röntgen-41,47,48 oder Protonenbestrahlung49 zu erzeugen. Unter Verwendung von 150-kVp-Röntgenstrahlen und azellulären ROS-Assays wurde festgestellt, dass Au-NPs zusätzliche •OH-Radikale erzeugen48. Es wurde vermutet, dass physikalische und katalytische Oberflächeneffekte sowie eine umgekehrte Größenabhängigkeit bei der chemischen Verstärkung durch Au-NPs eine Rolle spielen41,47,50,51. Aufgrund starker Assay-Interferenzen konnten wir diese Ergebnisse für Au-Nanopartikel in unserem Umfeld jedoch nicht bestätigen.

Zusammengenommen deuten die obigen Untersuchungen auf eine wichtige Rolle radiokatalytischer Prozesse in der chemischen Phase der Radioverstärkung durch Nanopartikel hin.

Zusätzlich zu den physikalischen und chemischen Beiträgen zur Dosiserhöhung wurden die Wirkungen der Nanopartikel-Dosiserhöhung in zellrelativ strahlenresistenten menschlichen Weichteilsarkomzellen (HT1080) anhand von Zellüberlebenskurven quantitativ bewertet (ergänzende Abbildung 7). Die in vitro beobachteten dosissteigernden Effekte wurden durch Berechnung des dosismodifizierenden Verhältnisses bei 50 % Zellüberleben (DMR50 %) bewertet. Dabei handelt es sich um das Verhältnis der Strahlendosen, die ohne und mit Nanopartikeln zum gleichen Effekt führten (ergänzende Abbildung 8). Abbildung 5 zeigt die DMRs, die für alle Nanopartikel und für die verschiedenen verwendeten Strahlungsquellen extrahiert wurden. Abgesehen von SiO2-Nanopartikeln, die als Negativkontrolle dienten (keine physikalische oder chemische Verstärkung unter Bestrahlung) und für die erwartungsgemäß keine nennenswerte Erhöhung der In-vitro-Dosis festgestellt wurde, zeigten alle Nanopartikel mit zunehmender Nanopartikelkonzentration erhöhte DMRs. Die höchsten Dosiserhöhungseffekte, bis zu 300 %, wurden für Au-Nanopartikel unter kV-Bestrahlung gefunden. Interessanterweise sank der Dosiserhöhungseffekt für Au-Nanopartikel unter MV-Röntgen- oder Protonenbestrahlung drastisch auf Werte knapp über dem Ausgangswert (<20 % Dosiserhöhung). Dies kann ausschließlich auf Strahlungseffekte als einzige Variable zurückgeführt werden, da die Nanopartikel und das Zellmodell für alle drei Bestrahlungsbedingungen (kV-, MV-Röntgenstrahlen und Protonen) exakt gleich waren. HfO2 zeigte unter kV-Röntgenstrahlung, MV-Röntgenstrahlung bzw. Protonenbestrahlung dosissteigernde Wirkungen von bis zu 200 %, 70 % bzw. 40 %. Beachten Sie, dass HfO2-Nanopartikel bei MV-Röntgen- und Protonenbestrahlung deutlich stärkere Verstärkungseffekte zeigten als Au, was möglicherweise ihren Erfolg in Kliniken rechtfertigt. Im Fall von WO3 wurden unabhängig von der Art der verwendeten ionisierenden Strahlung dosissteigernde Effekte von bis zu 50 % festgestellt. Interessanterweise waren die beobachteten Dosiserhöhungseffekte bei TiO2-Nanopartikeln bei kV- und MV-Röntgenbehandlungen vergleichbar und erreichten Werte von bis zu 150 %. Unter Protonenbestrahlung wurden für TiO2 bei der höchsten Dosis Verstärkungseffekte von bis zu 290 % beobachtet. Bei TiN-Nanopartikeln wurde bei subtoxischen Dosen bei kV- und MV-Röntgenbestrahlung eine Dosiserhöhung von bis zu 50 % festgestellt. Der stärkste Effekt von TiN-Nanopartikeln wurde bei Protonenbestrahlung mit Verstärkungen von bis zu 200 % festgestellt.

Dosismodifizierende Verhältnisse bei 50 % Zellüberleben (DMR50 %), beobachtet in vitro mit unterschiedlichen nominellen Nanopartikelkonzentrationen von SiO2 (a), TiO2 (b), TiN (c), WO3 (d), HfO2 (e) und Au (f). ) Nanopartikel in HT1080-Zellen; Daten aus der Überlebenskurve mit n = 15 unabhängigen biologischen Proben (3 Proben pro Röntgendosis) extrahiert und als Mittelwert ± SD aus mindestens 2 unabhängigen Zellchargen ausgedrückt.

Es gibt nur wenige Studien, in denen verschiedene Strahlungsquellen im selben Aufbau verglichen werden. Literaturdaten liegen ausschließlich für Au-Nanopartikel vor. Verfügbare Studien für Au-Nanopartikel deuten auf eine stark abgeschwächte Strahlenverstärkung bei MV-Röntgen- und Protonenbestrahlungsbedingungen im Vergleich zu kV-Röntgenstrahlung hin. Unsere Ergebnisse stimmen mit denen von Smith et al. überein. (2015), die Dosissteigerungen bei 5 Gy von ~60 % für 80-kVp-Röntgenstrahlen, 10 % für 6-MV-Röntgenstrahlen und <5 % für 150-MeV-Protonen unter Verwendung von mit 3 Gew.-% 5 nm Au imprägniertem Alaninwachs zeigten Nanopartikel29. In ähnlicher Weise haben Chithrani et al. (2010) fanden Verstärkungseffekte für 50-nm-Au-Nanopartikel von 66 % bei 105 kVp, die bei 6-MV-Röntgenbestrahlung unter Verwendung klonogener In-vitro-Assays auf 17 % abfielen52. Basierend auf der Literatur ist es offensichtlich, dass berichtete In-vitro-Dosissteigerungen, die für Au-Nanopartikel beobachtet wurden, am häufigsten im Bereich von 0–100 % für Röntgenstrahlen niedriger Energie (kV) und deutlich unter 50 % für MV-Röntgenstrahlen liegen12 ,53. Unsere Ergebnisse für 50-nm-Au-Nanopartikel bestätigen diese Beobachtungen und zeigten einen sehr ausgeprägten Rückgang der Wirksamkeit der Strahlenverstärkung bei klinisch relevanten MV-Strahlentherapie- und Protonentherapie-Einstellungen. Diese Ergebnisse verdeutlichen weiterhin die klaren Grenzen von 50-nm-Au-Nanopartikeln und verdeutlichen den dringenden Bedarf an Hochleistungs-Nanopartikel-Radioverstärkern mit rationaler Kernmaterialauswahl und Partikeldesign für klinisch relevante Hochenergiebestrahlung. Diese Ergebnisse bestätigen auch den klinischen Einsatz von HfO2-Nanopartikel-Radioverstärkern und weisen auf noch größere Vorteile bei katalytisch aktiven Materialien wie TiO2 in Kombination mit einer großen Oberfläche pro Volumen hin.

Um mechanistische Erkenntnisse zu gewinnen, korrelierten wir die In-vitro-Dosiserhöhungseffekte mit dem Nanopartikel-Volumenanteil (ergänzende Abbildung 9), um die relative Nanopartikelleistung zu vergleichen und eine Kontextualisierung unserer physikalischen und chemischen Dosiserhöhungsergebnisse zu ermöglichen. Für kV-Röntgenbestrahlung kann der relative Trend der DMR mit den physikalischen DEF-Simulationen sehr gut vorhergesagt werden, was gut mit früheren Erkenntnissen übereinstimmt31. Für dieses Energieregime spielt die Ordnungszahl eine entscheidende Rolle und trägt zu physikalischen Effekten bei (dh einer erhöhten Energiedeposition im Zytoplasma und Kern). Folglich war Au für kV-Photonen der effizienteste Radioverstärker, gefolgt von HfO2, gefolgt von TiO2 und TiN.

Bei Bestrahlungen mit MV-Photonenstrahlen wird die Ordnungszahldominanz durch die chemische Verstärkungsaktivität außer Kraft gesetzt. Die höchsten Dosissteigerungen unter 6-MV-Röntgenbestrahlung wurden für TiO2 und HfO2 erreicht. Bemerkenswerterweise zeigten unsere Ergebnisse, dass 50-nm-Au-Nanopartikel selbst bei vergleichsweise höheren Volumenanteilen weniger effizient waren als die Oxide.

Bei Protonenbestrahlung zeigten HfO2 und Au die geringste Strahlungsverstärkungseffizienz. Die Dosissteigerungswirksamkeit von HfO2-Nanopartikeln mit Protonen war im Vergleich zu denen mit kV- bzw. MV-Photonen fünf- bzw. zweimal geringer, was mit den Ergebnissen der chemischen Verstärkung übereinstimmt (siehe ergänzende Abbildung 4). Die Wirksamkeit der Protonendosissteigerung von Au-Nanopartikeln war vergleichbar mit der bei MV-Röntgenbestrahlung und etwa 20-mal niedriger als bei kV-Röntgenbestrahlung. Überraschenderweise übertrafen Materialien auf Titanbasis die anderen Materialien und zeigten eine stärkere Protonenverstärkung, als die hier vorgestellten physikalischen oder katalytischen Mechanismen vermuten lassen. Diese starke Dosiserhöhung wurde wahrscheinlich durch einen anderen Mechanismus verursacht, der für Protonenwechselwirkungen mit diesen Elementen spezifisch ist. Wenn natürliches Titan (48Ti) mit Protonen bombardiert wird, kann es über 48Ti(p,x)48V eine Kernreaktion eingehen, um das Positronen emittierende Radioisotop 48V54,55 zu erzeugen. In ähnlicher Weise kann der Protonenbeschuss auf Stickstoffziele über 14N(p,pn)13N- oder 14N(p,α)11C-Reaktionen die Positronenemitter 13N oder 11C erzeugen56. Während Positronenstrahler im Gegensatz zu Alphastrahlern im Allgemeinen für die Diagnostik mittels Positronenemissionstomographie nützlich sind, deuten neuere Studien darauf hin, dass Positronen auch für die Krebstherapie nützlich sein könnten57. Ob in unserem Fall Kernreaktionen oder andere biologische Mechanismen unter Protonenbestrahlung Ti- und N-haltige Materialien stärker verstärken als unter Röntgenstrahlen, sollte weiter untersucht werden. Literatur zur Protonenverstärkung mit TiO2- oder TiN-Nanopartikeln fehlt weitgehend.

Durch ionisierende Strahlung verursachte Zellschäden sind das Ergebnis kooperativer Beiträge indirekter und direkter Zellstressmechanismen, einschließlich ROS-Erzeugung, DNA-Schäden sowie Schäden an subzellulären Organellen und Autophagie58. Es wird angenommen, dass indirekte Wirkungen hauptsächlich durch Hydroxylradikale (•OH)59 vermittelt werden und schätzungsweise bis zu 90 % zur DNA-Schädigung oder Zellletalität beitragen60,61. Für geladene Teilchen wie Protonen wurde ein etwas bedeutenderer Beitrag der direkten Wirkung zur Zelltötung beschrieben, da sie stärker ionisieren als Röntgenstrahlen27. •OH-Radikale können mit Dimethylsulfoxid (DMSO) effizient gelöscht werden, um Zellen vor Röntgen- und Protonenschäden zu schützen27,60,62. Der maximale Schutzgrad wurde bei Konzentrationen von etwa 1 M DMSO61 gefunden. Hier untersuchten wir den Strahlenverstärkungsmechanismus von Nanopartikeln, indem wir DMSO in verschiedenen Konzentrationen verwendeten, um hydroxylvermittelte Schadensmechanismen zu unterdrücken.

Abbildung 6 zeigt die Auswirkungen der Radikallöschung während der kV-Röntgenbestrahlung. Die Strahlenbehandlung in Kombination mit DMSO und/oder Nanopartikeln zeigte sehr interessante Effekte. Die Konzentrationen der Nanopartikel wurden so gewählt, dass Strahlenverstärkungseffekte zu erwarten waren, während die Effekte der Scheinbestrahlung (0 Gy) vernachlässigbar waren (ergänzende Abbildung 10). Tatsächlich zeigten alle Nanopartikel dosissteigernde Effekte, die als Monodosis-Nanopartikel-Strahlungsverstärkungsverhältnis (NER oder RER63) ausgedrückt werden können. Wir geben dieses Verhältnis als an

Dabei ist SF6Gy die normalisierte überlebende Zellfraktion bei einer Dosis von 6 Gy. Für WO3-Nanopartikel betrug die NER ~1,6 mit oder ohne DMSO (Abb. 6f). Bei allen anderen Nanopartikeln verringerten steigende DMSO-Konzentrationen den strahlungsverstärkenden Effekt der Nanopartikel, bis die Effektsättigung eintrat. Der vollständige Schutz vor radioaktiven Nanopartikeleffekten wurde mit TiN-Nanopartikeln und 0,1 M DMSO oder mehr beobachtet und zeigte einen NER von 1,3 ohne DMSO und einen NER von nahe 1,0 mit DMSO. Für TiO2-, HfO2- und Au-Nanopartikel sanken die NERs von 2,0, 2,1 und 1,6 (kein DMSO) auf 1,3, 1,5 bzw. 1,4 bei >0,5 M DMSO. Mit anderen Worten, die Zugabe von DMSO unterdrückte die gesamten Strahlungsverstärkungseffekte der Nanopartikel um bis zu 73 % für TiO2, 52 % für HfO2 und 34 % für Au-Nanopartikel (ergänzende Abbildung 11). Diese Prozentsätze spiegeln die durch •OH-Radikale vermittelte Verstärkung der Zellschädigung wider. Eine kurze Behandlung mit bis zu 1 M DMSO allein zeigte keine negativen Auswirkungen auf das Zellwachstum (ergänzende Abbildung 10a). Bei nanopartikelfreien Proben wurden nach 6-Gy-Röntgenbehandlung Zellüberlebensanteile von 70–80 % gefunden, die in Gegenwart von DMSO bei Konzentrationen von 0,1 M oder höher auf 90 % anstiegen (Abb. 6). Diese Ergebnisse stimmen mit früheren Berichten überein, in denen der Prozentsatz der indirekten Maßnahmen 63–89 % betrug60,61,62,64. Die verbleibende, nicht durch DMSO unterdrückte Erhöhung der Nanopartikeldosis muss auf andere physikalische, chemische oder biologische Schadensmechanismen zurückzuführen sein.

Einfluss von DMSO (Hydroxyl-Radikalfänger) auf die überlebende Fraktion (SF) von HT1080-Zellen mit und ohne Nanopartikel nach Bestrahlung mit 6 Gy von 150 kVp-Röntgenstrahlen. Die Zellen wurden mit 160 µg/ml TiO2 (a), 80 µg/ml TiN (b), 160 µg/ml WO3 (c), 320 µg/ml HfO2 (d) und 40 µg/ml Au-Nanopartikeln vorinkubiert (e) für 24 Stunden vor der DMSO- und Röntgenbehandlung. Monodosis-Nanopartikel-Verstärkungsverhältnis (NER) bei 6 Gy ohne und mit 1 M DMSO (f). Daten in a–f, ausgedrückt als Mittelwert ± SD aus n = 8 biologischen Replikaten, die über 2 unabhängige CellTiter Glo-Experimente für jeden Nanopartikeltyp oder jedes Vehikel untersucht wurden.

Es wurde gezeigt, dass TiO2 zellulären Stress aktiviert und die Stoffwechselkapazität reduziert65, die Werte von intrazellulären ROS, entzündungsbedingten Genen und Apoptose erhöht und die GSH-Werte senkt66. Es wurde auch über eine erhöhte DNA-Schädigung und Mikrokernbildung berichtet, ein wahrscheinlicher Mechanismus der Genotoxizität.67 Dennoch zeigten unsere Ergebnisse, dass der größte Teil (>73 %) der Nanopartikelverstärkung auf die Produktion von ROS, insbesondere •OH, während der Bestrahlung mit ionisierender Strahlung zurückzuführen war. Youkhana et al. (2017) führten die In-vitro-Dosiserhöhung von TiO2 auch auf eine erhöhte ROS-Erzeugung zurück, basierend auf wässrigen DCFDA-Ergebnissen68. Hier konnten wir schlüssig zeigen, dass dieser oxidative Stress während der Bestrahlung höchstwahrscheinlich aufgrund der katalytischen Oberflächeneffekte von TiO2 zunahm, da in unseren nanoskopischen und mikroskopischen Modellen keine physikalische Dosiserhöhung festgestellt wurde.

Die DMSO-Zugabe schwächte die Nanopartikelverstärkung durch HfO2 und Au mit hohem Z-Nanopartikel nur teilweise ab. Daher könnte bei kV-Röntgenbestrahlung für Nanopartikel mit hohem Z eine direkte DNA-Schädigung auftreten, was mit unseren Simulationen der mikroskopischen Dosisablagerung im Zellkern übereinstimmt. Darüber hinaus könnte die Bildung von •OH-Radikalen im Zytosol eine Kombination aus physikalischen und oberflächenkatalytischen Prozessen für diese High-Z-Materialien bei kV-Röntgenenergien sein. Interessanterweise könnten zytoplasmatische Prozesse, die zur Zerstörung von Organellen wie Mitochondrien oder Lysosomen führen, eine wichtige Rolle bei der durch Nanopartikel vermittelten Strahlenverstärkung spielen69,70. Zuletzt wurde auch gezeigt, dass bereits sehr geringe Konzentrationen von 10 nm großen Au-Nanopartikeln einen Einfluss auf die Zellzyklusphase, den Anteil strahlenempfindlicher G2-Zellen sowie die DSB-Reparaturkinetik haben können71. Daher ist die durch Nanopartikel vermittelte Strahlungsreaktion komplex, da sowohl die Sensibilisierung von Krebszellen als auch die Dosiserhöhung zur Gesamtreaktion beitragen.

Das einzige Nanomaterial, bei dem DMSO keinen Einfluss auf die Wirksamkeit der Strahlenverstärkung zeigte, war WO3. Da sich in unserem Fall WO3-Nanopartikel vor der Bestrahlung auflösten, muss ihre Wirkung durch niedrige Konzentrationen freier Wolframionen bestimmt werden. Unter Verwendung von löslichem Natriumwolframat wurde gezeigt, dass Wolfram den Zellzyklusverlauf verändern, Zytokinprofile stimulieren und DNA-Schäden und Apoptose erhöhen kann72,73,74. Darüber hinaus wurde berichtet, dass Wolframat die Aktivierung der zentralen Doppelstrangbruch-Signalkinase (DSB) ATM moduliert und Zellen für DNA-DSB-induzierende Wirkstoffe wie ionisierende Strahlung sensibilisiert75. Ein solcher biologischer Sensibilisierungsmechanismus könnte unsere Ergebnisse erklären, dass (gelöste) WO3-Nanopartikel HT1080-Zellen unter Röntgen- oder Protonenbestrahlung in ähnlichem Ausmaß sensibilisierten, ohne den oxidativen (OH-Radikal-)Stress zu erhöhen.

Für die in dieser Studie verwendeten Nanomaterialien postulieren wir folgende Wirkmechanismen:

Siliziumdioxid: SiO2 ist ein biologisch relativ inertes Nanomaterial, das keine relevanten ROS oder Zellsensibilisierung erzeugt oder zu beobachtbaren Dosiserhöhungseffekten führt. Es kann als Kontrolle für weitere Studien zur Strahlenverstärkung verwendet werden.

Titannitrid: Für TiN-Nanopartikel wurde keine physikalische Dosiserhöhung im Zytoplasma oder Zellkern gefunden. TiN könnte die antioxidative Kapazität verringern und Krebszellen gegenüber ionisierender Strahlung empfindlich machen. Bei niedrigen DMSO-Konzentrationen war der dosissteigernde Effekt vollständig verringert. Unter Protonenbestrahlung können jedoch nukleare Effekte von 48Ti- und 14N-Atomen eine zusätzliche Rolle spielen, die zu einer in vitro beobachteten Erhöhung der Protonendosis führen.

Titandioxid: Die in vitro Dosiserhöhung durch TiO2-Nanopartikel unter Röntgenbestrahlung zeigte keine Energieabhängigkeit. Eine physikalische Dosiserhöhung in Vesikeln, Zytoplasma oder Zellkern kann ausgeschlossen werden. Ionisierende Strahlung erzeugte über katalytische Reaktionen zellulären oxidativen Stress, der unter Röntgenstrahlung höher war als unter Protonenbestrahlung. Ein zusätzlicher biologischer Effekt (<30 %) könnte eine signifikante Rolle spielen, da die meisten, aber nicht alle Dosiserhöhungen durch DMSO unterdrückt wurden. Um hohe Dosissteigerungseffekte zu zeigen, war eine hohe Verfügbarkeit von Nanopartikeln pro Zelle erforderlich. Dies wurde durch das niedrige Toxizitätsprofil ermöglicht. Unter Protonenbestrahlung können nukleare Effekte eine zusätzliche Rolle bei der weiteren Verstärkung der Zellschädigung spielen.

Wolframoxid: WO3-Nanopartikel können bei kV-Röntgenbestrahlung eine physikalische Dosiserhöhung und bei allen verwendeten ionisierenden Strahlungsquellen eine oberflächenkatalytische ROS erzeugen. Allerdings führte die Auflösung der Nanopartikel – wahrscheinlich in lysosomalen Kompartimenten – zu einem niedrigen Wolframgehalt pro Zelle und zu einer eher biologischen als oxidativen Sensibilisierung der Zellen gegenüber Röntgen- und Protonenbestrahlung.

Hafniumdioxid: HfO2-Nanopartikel erhöhten die Dosis im Zellkern und verstärkten den zellulären oxidativen Stress durch Dosisdeposition im Zytoplasma sowie durch katalytische Oberflächenreaktionen unter kV-Röntgenstrahlen. Katalytische Prozesse wurden unter MV-Röntgenbestrahlung reduziert und waren unter Protonenbestrahlung am niedrigsten. Zusätzlich zu einem sehr geringen Toxizitätsprofil zeigten HfO2-Nanopartikel den Nachweis einer In-vitro-Dosiserhöhung, die durch physikalische und chemische Phänomene unter Photonen- und Protonenbestrahlung gesteuert wird.

Gold: 50-nm-Au-Nanopartikel zeigten hohe Dosiserhöhungseffekte bei kV-Energien, die teilweise (<35 %) durch indirekte (durch OH-Radikale vermittelte) und größtenteils durch direkte (Dosis auf Kern oder Zytoplasma) Dosiserhöhungseffekte gerechtfertigt werden können. Diese Effekte wurden durch ionisierende Strahlung bei MV-Energien stark reduziert. Die anwendbare Nanopartikeloberfläche eines 50-nm-Nanopartikels ist 100-mal kleiner als die eines 5-nm-Nanopartikels, wodurch mögliche Dosiserhöhungseffekte aufgrund katalytischer Oberflächenprozesse im Vergleich zu allen anderen Nanopartikeln reduziert werden.

Unsere Studie untersuchte umfassend die physikalischen, chemischen und in vitro dosissteigernden Effekte von Nanopartikeln mit niedrigem Z (SiO2, TiO2 und TiN) und hohem Z (WO3, HfO2 und Au) während der Bestrahlung mit kV- und MV-Photonen und Protonen direkt vergleichbare Einstellungen. Daraus können wertvolle allgemeine Erkenntnisse gewonnen werden, die als Grundlage für ein rationalisiertes Nanopartikel-Radioenhancer-Design für die jeweiligen Bestrahlungseinstellungen und Behandlungsmodalitäten dienen. Wir haben schlüssig gezeigt, dass die Dosiserhöhung unter kV-Röntgenbestrahlung durch physikalische Dosiserhöhungseffekte dominiert wird, die zu einer erhöhten Dosisdeposition im Zytoplasma und Zellkern der Zelle führen können. Die In-vitro-Radioverstärkung war bei Nanopartikeln mit hohem Z-Gehalt (Au) am höchsten. Allerdings wurden diese physikalischen Dosiserhöhungseffekte bei hochenergetischen Photonen und Protonen stark abgeschwächt. Unter den klinisch relevantesten MV-Photonen- und Protonenbestrahlungsbedingungen kommt der katalytischen Aktivität von Nanopartikeln eine entscheidende Bedeutung zu und die Ordnungszahl des Kernmaterials spielt nur eine untergeordnete Rolle. Um die oberflächenkatalytische ROS-Erzeugung zur Dosissteigerung voll auszunutzen, müssen die zugänglichen Oberflächen von Radioverstärkern maximiert werden. Interessanterweise könnten titan- und stickstoffhaltige Nanopartikel aufgrund möglicher nuklearer Effekte zusätzliche Vorteile für die Protonenverstärkungstherapie bieten.

Zusammenfassend ermöglichen die Ergebnisse dieser umfassenden Studie die Extraktion wichtiger allgemeiner Designprinzipien für Nanopartikel-Radioverstärker für kV- und MV-Photonen- und Protonentherapien auf der Grundlage quantitativer und vergleichender Daten. Während die Aufnahme von Nanopartikeln, die Zelltoxizität und die Strahlenverstärkung von der Zelllinie abhängen, haben frühere Arbeiten an verschiedenen Krebszelllinien gezeigt, dass die relativen Trends in der Wirksamkeit von Strahlenverstärkern zutreffen, wenn auch mit leicht unterschiedlichen absoluten Werten31. Zukünftige Untersuchungen sollten sich auf die weitere Erforschung des Materialdesignraums auf der Grundlage solcher vergleichender, gut standardisierter Einstellungen und die Validierung der Strahlenverstärkungsleistung in Tiermodellen und mit verschiedenen Zelltypen konzentrieren. Mögliche Auswirkungen der Oberflächenfunktionalisierung von Nanomaterialien auf die Dosiserhöhung sollten sorgfältig untersucht werden, einschließlich einer möglichen Löschung von ROS durch antioxidative Moleküle (wie Dopamin) sowie potenziell synergistischer Effekte, die zu einer verstärkten ROS-Erzeugung führen, z. B. durch Porphyrine. Letztendlich wird die in den Krebszellen erreichte wirksame Nanopartikelkonzentration die Dosissteigerung bestimmen. Während experimentelle Untersuchungen in Mausmodellen an intravenös injizierten Nanopartikeln gezeigt haben, dass sich nur ein kleiner Teil der injizierten Nanopartikel in Krebszellen ansammeln kann, scheint die intratumorale Verabreichung von HfO2-Nanopartikeln (NBTXR3) das Abgabeproblem teilweise zu lösen und zeigt eine überzeugende therapeutische Wirksamkeit in präklinischen und klinischen Studien klinische Einstellungen. Diese Wirksamkeit kann jedoch durch die Optimierung von Radioenhancer-Designs, teilweise basierend auf den Erkenntnissen dieser Arbeit, noch weiter verbessert werden.

Um den Einfluss von Nanopartikeln auf die Energiedeposition abzuschätzen, wurden physikalische Bühnensimulationen mit der Erweiterung TOPAS-nBio76,77 und dem Toolkit TOPAS78,79 durchgeführt, das auf dem Monte-Carlo-Simulationssystem Geant480 basiert. Für die Simulation des Partikeltransports innerhalb der Zelle verwendeten wir die standardmäßige Geant4-DNA-Track-Strukturphysikliste81, einschließlich des vollständigen Auger-Abregungskaskadenprozesses35 mit aktivierter Fluoreszenz, Auger-Elektronenproduktion und partikelinduzierter Röntgenemission. Das Energiebereichsminimum wurde auf 10 eV festgelegt. Da dieses Physikmodul nur den Transport in H2O unterstützt, haben wir die kondensierte EMStandardOption4-Physikliste in allen Nanopartikelregionen verwendet, einschließlich Nanopartikeln aus Wasser, und einen Bereichsschnitt von 1 nm für alle Partikel angegeben. Der Dosiserhöhungsfaktor (DEF) wurde als das Verhältnis der erzielten Dosis zum Zytosol, Zellkern oder zu Wasserhüllen in Gegenwart der interessierenden Nanopartikel zu der Dosis mit Wassernanopartikeln definiert. Simulationen mit Röntgenstrahlen wurden auf einer MacOS Catalina-Distribution unter Verwendung von TOPAS Version 3.5 unter Verwendung von Dreifachkopien von 108 Historien durchgeführt. Das Röntgenspektrum der 150-kVp-Quelle wurde mit der XRayGUI (Version 1.4.2.0, BAM Bundesanstalt für Materialforschung und -prüfung, Berlin, Deutschland) simuliert, die den experimentellen Bedingungen möglichst genau entsprach. Für das Röntgenspektrum der 6-MV-Quelle wurde die bereits veröffentlichte Partikelfluenz in einem Wasserphantom eines Varian Linac von Choi et al. extrahiert. (2019)82. Protonensimulationen mit einem 100 (±1 %) MeV-Strahl wurden auf einer CentOS7-Linux-Distribution auf dem hpc-Euler-Cluster der ETHZ unter Verwendung von TOPAS Version 3.7 und Dreifachkopien von 3,33 × 105-Historien durchgeführt.

Für die nanoskopischen Simulationen wurde ein einfaches Vesikelmodell bestehend aus einer 400 nm großen Wasserkugel und zufällig verteilten 50 nm großen Nanopartikeln in einem Wasserwürfel mit 20 µm Seitenlänge (Röntgenstrahlen) bzw. 6 µm Seitenlänge (Protonen) zentriert. Bewertet wurde die Dosis innerhalb des Vesikels sowie die Dosis um das Vesikel herum innerhalb von 100 nm Wasserhüllen bis zu einer Entfernung von 1 µm. Die Strahlgröße betrug 4 µm und gewährleistete so ein gleichmäßiges Bestrahlungsfeld auch um das Vesikel herum. Es wurden Nanopartikel mit einer Größe von 50 nm ausgewählt, da kleinere Nanopartikel für physikalische Bühnensimulationen nur einen vergleichsweise geringen Einfluss auf die umgebende Energiedeposition haben38, jedoch die Rechenzeit enorm erhöhen. Die Materialien der Nanopartikel wurden anhand des Metall- und Sauerstoff- oder Stickstoffmassengehalts definiert, wie in der Ergänzungstabelle 1 angegeben. Für Protonensimulationen war es wichtig, nur die Dosis im nanopartikelfreien Raum zu bewerten und zu vergleichen. Für die mikroskopischen Dosiserhöhungssimulationen wurde eine einfache Zellgeometrie bestehend aus einer äußeren Wasserkugel mit einem Durchmesser von 6 µm und einer inneren Wasserkugel mit einem Durchmesser von 3 µm modelliert, die das Zytosol bzw. den Zellkern darstellt. Dies lag nahe am Zytosol/Kern-Verhältnis von 1,7, wie es von Lin et al.83 und Rudek et al.38 verwendet wurde. Für Röntgensimulationen wurde die Zelle in einem kubischen Wasserkasten mit einer Seitenlänge von 20 µm zentriert, während sie für Protonensimulationen in einem kleineren, 6 µm langen kubischen Wasserkasten zentriert wurde, um die Rechenzeit zu verkürzen. Im Zellmodell wurden alle Nanopartikel in Vesikeln mit einem Durchmesser von 400 nm an einer vordefinierten Position und einem Volumenanteil von 32,4 % platziert. Unterschiedliche Mengen solcher mit Nanopartikeln gefüllten Vesikel wurden dann nur im Zytoplasma platziert, da Metalloxide oder Au-Nanopartikel überwiegend über endozytotische Wege in die Zellen gelangen und sich in etwa 300–500 nm großen Vesikeln im Zytoplasma ansammeln und selten in den Zellkern gelangen31,84 . Der Teilchenstrahl (Röntgenstrahlung oder Proton) hatte den gleichen Durchmesser wie die Zelle.

Die folgenden Metallvorläufer und Lösungsmittel wurden verwendet: Titan(IV)-isopropoxid (Sigma-Aldrich, 97 %), Hafnium(IV)-isopropoxid-Isopropanol-Addukt (Alfa Aesar, 99 %), Ammonium(meta)wolframathydrat (Sigma-Aldrich, ≥ 85,0 %), 2-Ethylhexansäure (2-EHA) (Sigma-Aldrich, 99 %), Xylol (Sigma-Aldrich, ≥98,5 %), Ethanol absolut (VWR Chemicals, ≥99,8 %), Diethylenglykolmonobutylether (Sigma -Aldrich, ≥98,0 %). 50 nm große Au-Nanokugeln (Citrat, BioPureTM) in gereinigtem USP-Wasser (1 mg/ml) wurden von nanoComposix Inc (San Diego, USA) gekauft. Hydrophile pyrogene Siliziumdioxid-Nanopartikel (Aerosil®, A380) wurden von der Evonik Industries AG (Essen, Deutschland) bezogen.

TiO2-, HfO2- und WO3-Nanopartikel wurden mittels Flammensprühpyrolyse synthetisiert, wie an anderer Stelle ausführlich beschrieben31,85,86. Der Vorläufer zur Herstellung von TiO2-Nanopartikeln wurde durch 30-minütiges Rühren von Titanisopropoxid und Xylol bei einer Metallkonzentration von 0,16 M hergestellt. Ebenso wurde die WO3-Vorläuferlösung durch Mischen von Ammonium(meta)wolframathydrat mit Diethylenglykolmonobutylether und Ethanol (1:1) bei einer Metallkonzentration von 0,2 M hergestellt. Im Fall von HfO2 wurde das Hafniumisopropanol-Addukt zunächst in 2 gelöst -EHA durch Rühren bei 120 °C unter Rückflusskühlung für mehrere Stunden bei 0,96 M. Nach dem Abkühlen wurde es 1:5 mit Xylol verdünnt, wodurch eine Endmetallkonzentration von 0,16 M erreicht wurde. Die flüssigen Vorläuferlösungen wurden durch eine Kapillare mit zugeführt Flussraten von 3 ml/min (HfO2, TiO2) oder 5 ml/min (WO3) und dispergiert durch O2 (PanGAS, Reinheit > 99 %) mit einer Flussrate von 5 l/min in feine Tröpfchen. Der Druckabfall an der Kapillare wurde konstant bei 1,6 bar gehalten. Eine vorgemischte ringförmige CH4/O2-Flamme (1,5 L min−1/3,2 L min−1) zündete und stabilisierte die Sprühflamme. In der Gasphase gebildete Partikel wurden mit Hilfe einer Vakuumpumpe (Busch Mink MM 1202 AV) auf einem Glasfaserfilter (Typ GF6, Hahnemühle FineArt GmbH) gesammelt. Das aus dem Filter gesammelte Nanopartikelpulver wurde anschließend gesiebt (Maschenweite = 250 μm), um eventuelle Filterrückstände zu entfernen. Titannitrid (TiN)-Nanopartikel wurden aus FSP-TiO2-Nanopartikeln nach einer zuvor etablierten Nitridierungsmethode87 hergestellt. Titanoxidpartikel wurden in einem U-förmigen Quarzreaktor unter reinem Ammoniakstrom (75 ml/min) und einer Wärmebehandlung bei 700 °C auf Quarzwolle nitriert. Die erste Aufheizrate bis 600 °C betrug 20 °C/min, gefolgt von einer zweiten Aufheizrate von 3 °C/min, bis die Zieltemperatur von 700 °C erreicht und 30 h gehalten wurde. Nach der Wärmebehandlung wurde das Pulver mit einer Geschwindigkeit von 40 °C/min auf Raumtemperatur abgekühlt und bei Raumtemperatur sanft oxidiert (unter Verwendung von 5 % Sauerstoff in Argon).

Die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM)-Bildgebung wurde mit einem JEOL 2200FS TEM durchgeführt, das bei 200 kV betrieben wurde. TEM-Proben wurden durch Tropfengießen von Dispersionen von 100 μg/ml in Reinstwasser oder EtOH auf kohlenstoffbeschichtete Gitter (200 Mesh Kupfer, EM Resolutions) hergestellt. Röntgenbeugungsmuster wurden mit einem Bruker 2D Phaser mit einer Schrittgröße von 0,01° erhalten. Die Rietveld-Verfeinerung wurde mit Profex88 (Version 4.2.5) durchgeführt. XRD-Muster sowie Verfeinerungsergebnisse sind in der ergänzenden Abbildung 12 dargestellt. Die spezifische Oberfläche (SSA) der Partikel wurde basierend auf der N2-Adsorption bei 77 K unter Verwendung des Brunauer-Emmett-Teller (BET) (Tristar II Plus, Micrometrics) gemessen. Methode. Vor der Messung wurden alle Proben für mindestens 45 Minuten bei 150 °C in N2 entgast. Der Primärpartikeldurchmesser dBET wurde mithilfe der Gleichung \({{d}}_{{{{{{\rm{BET}}}}}}}[{{{{{\rm{nm}}}} geschätzt. }}]=\frac{6000}{{{{{{\rm{SSA}}}}}}\left[{{{{{\rm{m}}}}}}}^{2}{ {{{{{\rm{g}}}}}}}^{-1}\right]{{{{{\rm{\rho }}}}}}[{{{{{\rm{g }}}}}}\; {{{{{\rm{c}}}}}}{{{{{{\rm{m}}}}}}}^{-3}]}\). Die Schüttgutdichten sind in Tabelle 1 angegeben. Hydrodynamische Größenmessungen wurden mittels dynamischer Lichtstreuung (DLS) auf einem Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) bei einem Streuwinkel von 90° und einer Konzentration von 0,1 mg/ml erfasst in hochreinem Wasser. Alle Nanopartikelsuspensionen wurden vor der Messung mindestens 15 Minuten lang im Bad beschallt. Zur Beurteilung des organischen Oberflächengehalts wurde eine thermogravimetrische Analyse (TGA) mit einem NETZSCH TG 209 F1-Gerät (NETZSCH-Gerätebau GmbH, Selb, Deutschland) mit einer Heizrate von 10 °C/min unter Stickstoffstrom durchgeführt. Die TGA sowie ihr erstes Differential (DTG) finden Sie in der ergänzenden Abbildung 13.

Menschliche Fibrosarkom-HT1080-Zellen (ATCC®CCL121TM) wurden in minimalem essentiellen Medium Eagle (MEM, Sigma-Aldrich oder Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS, Sigma-Aldrich), 1 % L-Glutamin (Sigma-Aldrich), kultiviert. , 1 % Penicillin-Streptomycin (PS, Sigma-Aldrich), 1 % nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA, Sigma-Aldrich) und 1 mM Natriumpyruvat bei 37 °C unter einer feuchten Atmosphäre mit 5 % CO2. Die Subkultivierung wurde bei 70–80 % Konfluenz durch Behandlung mit 0,5 % Trypsin-EDTA (Sigma-Aldrich) durchgeführt.

Um intrazelluläre Nanopartikel abzubilden, wurden 1,4 × 105 Zellen in T25-Kolben in 8 ml Medium ausgesät und über Nacht anhaften gelassen. 700 μL einer 1 mg/ml Nanopartikelsuspension in Reinstwasser wurden zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit PBS gewaschen, mit 1 ml Accutase (Sigma-Aldrich) abgelöst, mit PBS gewaschen und über Nacht mit 2,5 % Glutaraldehyd und 4 % Paraformaldehyd in PBS fixiert. Die Zellpellets wurden dann 20 Minuten lang mit 0,1 M Cacodylatpuffer gewaschen und 1 Stunde lang mit 2 % Osmiumtetroxid und 1,5 % Kaliumferricyanid gefärbt. Nach der schrittweisen Dehydratisierung über einen Ethanolgradienten (50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 100 %, 100 %) erfolgte die Einbettung in ein Epoxidharz (EPON 812 Kit, Sigma-Aldrich). Dies wurde durch Mischen und Zugabe von Harz und Ethanol im Verhältnis 1:2 (5 Tage), 1:1 (3 Stunden), 1:0 (3 Stunden), 1:0 (24 Stunden) zu den Pellets erreicht. Anschließend wurden die Harzblöcke 48 Stunden lang in einem Ofen bei 60 °C ausgehärtet. Anschließend wurden mit einem Ultramikrotom (Scope M) dünne Schnitte von ~100 nm aus den Blöcken geschnitten. Die Schnitte wurden mit einem Hitachi S-4800 Rasterelektronenmikroskop abgebildet, das im Transmissionsmodus bei 20 oder 30 kV betrieben wurde.

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit dem CellTiter-Glo (CTG)-Assay (CellTiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay, Promega, G7571) gemäß den Angaben des Herstellers, jedoch angepasst an unseren Aufbau, ermittelt. CTG-Puffer und Substrat wurden aufgetaut und gemischt, und 300 µL Zellmedium (aus den Versuchsvertiefungen) wurden durch 200 µL CTG-Reagenz ersetzt. Nach 20-minütiger Inkubation im Dunkeln auf einem Schüttler und 30-minütiger Äquilibrierung im Dunkeln wurde die Lumineszenz (Integrationszeit 1 s) mit einem Mikroplattenlesegerät (Mithras LB 943 Multimode) gemessen. Ein selbst hergestellter Adapter aus schwarzem Titan wurde verwendet, um Übersprechen zwischen den Wells zu verhindern. Diese Methode wurde durch den Vergleich der Lumineszenz von 20.000 Zellen pro Vertiefung mit und ohne Adapter etabliert (ergänzende Abbildung 14a). Es wurde festgestellt, dass der Adapter das Lumineszenz-Crosstalk eliminierte, was zu einer gleichmäßigen Verteilung des Lumineszenzsignals auf der Platte führte. Es wurde eine Lumineszenzstandardabweichung von 5,0 % mit Adapter im Vergleich zu 13,9 % ohne Adapter erreicht. Es wurde eine Zellstandardkurve mit N = 3 unabhängigen biologischen Experimenten mit Duplikaten durchgeführt und damit konnten wir die Lumineszenz in die Anzahl der Zellen (#Zellen) umrechnen über: \({{{{{\rm{\#Zellen}} }}}}=x=\frac{y{b}}{{a}-{b}}\), wobei y das Lumineszenzsignal ist und a = 3,872 × 106 und b = 3,431 × 105 Anpassungsparameter sind (R2 = 0,991) (weitere Einzelheiten siehe ergänzende Abbildung 14b).

Ein PMMA-Phantom, bestehend aus zwei gleich großen Platten (4 × 40 × 40 cm3), wurde selbst hergestellt und für alle Röntgenexperimente verwendet. Eine zentrale Aussparung wurde so konzipiert, dass sie in eine 48-Well-Platte passt (TPP, Techno Plastic Products AG, Schweiz). Somit wanderten Photonen durch ~3 cm PMMA-Phantommaterial, bevor sie auf die Oberseite der 48-Well-Platte trafen (ergänzende Abbildung 15a). Für die kV-Röntgenbestrahlung wurde eine Röhrenquelle (Seifert ISOVOLT 450, GE Sensing & Inspection Technologies GmbH, Deutschland) mit einem 7 mm Beryllium-Filterfenster 50 cm über der unteren Phantomplatte positioniert und mit 150 kV und 20 mA betrieben. Die Dosisleistung an der Zellplatte betrug ~1,5 Gy/min. Eine kalibrierte Ionisationskammer (N31003, PTW, Freiburg, Deutschland) wurde über einen 8-mm-Einlass zur zentralen Aussparung geführt und mit einem UNIDOS-Dosimeter (PTW, Freiburg, Deutschland) verbunden, um die Dosisleistung innerhalb des Phantoms vor der Zellbestrahlung zu messen. sowie während der Bestrahlung zur Sicherstellung der Dosisversorgung. Die MV-Röntgenbestrahlung wurde im Krankenhaus an einem klinischen Linearbeschleuniger (TrueBeam®, Varian, Paolo Alto, CA) bei 6 MV mit einer Feldgröße von 20 × 20 cm2 und einer Dosisleistung von 5,7 Gy/min durchgeführt. Der Abstand zwischen dem Strahlfokus und der oberen Platte des Phantoms betrug 100 cm. Die Bestrahlungsplanung erfolgte über das eclipseTM-Behandlungsplanungssystem mit dem Acuros®-Algorithmus (Varian, Paolo Alto, CA) und CT-Bildgebung (SOMATOM Definition, Siemens, Erlangen, Deutschland) der Platte im Phantom. Messungen mit EBT3-Dosimetriefilmen bestätigten die Genauigkeit der Dosisberechnungen und die hohe Homogenität mit einer Standardabweichung von 0,82 %. Ein mit 4 Gy bestrahlter Film wurde mit einem aus einem kV-bestrahlten EBT3-Film kreuzvalidiert. Protonenbestrahlungen (ergänzende Abb. 15b) wurden am Gantry 2 (PSI, Paul Scherrer Institut, Villigen, Schweiz) mit einem 100 MeV (Δp/p = 1 %) Protonenstrahl durchgeführt. Der Plateaubereich der Bragg-Peak-Kurve im Shoot-Through-Modus unter Verwendung der Spot-Scanning-Technik wurde verwendet, um ein gleichmäßiges Dosisfeld zu liefern. Die Bestrahlungsfeldgröße betrug 10 × 15,2 cm2 mit einem Punktabstand von 0,4 cm in x- und y-Richtung. Eine Advanced Markus Ionisationskammer (PTW, Freiburg, Deutschland) wurde verwendet, um eine Dosisabgabe von besser als 1 % zu überprüfen und wurde durch zusätzliche EBT3-Filmmessungen bestätigt.

Der DCF-Assay wurde von Zhao und Riediker (2014)89 übernommen. 2′,7′-Dichlordihydrofluorceindiacetat (H2DCF-DA)-Pulver (Sigma-Aldrich) wurde in Dimethylsulfoxid (DMSO, Sigma-Aldrich) gelöst, um eine Konzentration von 5 mM zu erreichen. Aliquote davon wurden zur weiteren Verwendung bei –20 °C gelagert. Die aufgetaute H2DCF-DA-Stammlösung wurde mit NaOH (10 mM) 1:4 gemischt und 30 Minuten im Dunkeln inkubiert. Anschließend wurde es mit Tris-HCl-Puffer (0,1 M, pH = 7,4) auf 8 μM verdünnt. Die endgültige H2DCF-Arbeitslösung wurde die ganze Zeit über im Dunkeln auf Eis gehalten. Alle Nanopartikel wurden gewogen, dispergiert und in Tris-HCl-Puffer beschallt, wodurch eine 10-fache Stammkonzentration erreicht wurde. Vor der Bestrahlung wurden 0,1 ml Tris-HCl-Puffer, 0,1 ml Nanopartikelsuspension und 0,8 ml H2DCF-Arbeitslösung identisch in die Vertiefungen zweier transparenter 24-Well-Platten gegeben. Die endgültigen Nanopartikelkonzentrationen betrugen 36,8, 368 und 1840 cm2/ml. Eine Platte diente als 0 Gy-Referenzplatte, die andere Platte wurde im Phantom mit 12 Gy bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde die Flüssigkeit aus den Vertiefungen in Mikroröhrchen zentrifugiert und der Überstand in dreifacher Ausführung auf transparente Platten mit 96 Vertiefungen übertragen. Das Fluoreszenzsignal wurde mit einem Mikroplattenlesegerät (485 nm Anregung, 535 nm Emission, Tecan Infinity 200Pro oder Mithras LB 943 Multimode) gemessen. Die durchschnittlichen 0 Gy-Fluoreszenzwerte, Fl0Gy, jedes Partikels oder Blindwerts wurden von den 12 Gy-Durchschnittswerten, Fl12Gy, abgezogen. Die Dosissteigerungsfaktoren (DEFROS) wurden dann anhand der Fluoreszenzintensität (FI) wie folgt berechnet:

2000 HT1080-Zellen in 300 µL Zellmedium wurden in 48-Well-Platten ausgesät und 24 Stunden lang zur Adhäsion gebracht. Danach wurden die Zellen mit 200 µL verschiedener Nanopartikel- oder Kontrolllösungen inkubiert, um endgültige Nanopartikelkonzentrationen von 0–320 µg/ml zu erreichen. Um unterschiedliche Nanopartikelkonzentrationen für die Zellinkubation zu erreichen, wurden Lösungen aus einer frischen und 30 Minuten lang im Bad beschallten 3,2 mg/ml Nanopartikel-milliQ-Stammlösung hergestellt, die in unterschiedlichen Volumina zu festen Mengen Zellmedium gegeben wurde. MilliQ wurde verwendet, um die Lösungen anzupassen, um die richtige Konzentration und eine feste Menge (10 %) Wasser in jeder Lösung zu erreichen. Nanopartikelfreie Lösungen bestanden auch aus Zellmedium und 10 % MilliQ-Wasser. Nach 24 Stunden wurden die Zellen zweimal mit 250 µL PBS gewaschen. Anschließend wurden 500 µL Zellmedium hinzugefügt. Für den Transport zu und von den verschiedenen Bestrahlungsanlagen wurden die Zellen in einer Kühlbox aufbewahrt. Die Bestrahlung erfolgte bei Raumtemperatur. Nach dem Bestrahlungsverfahren wurden die Zellen unter Standardbedingungen inkubiert und das Medium zwei Tage später gewechselt. Am 5. Tag nach der Bestrahlung wurde die Lebensfähigkeit der Zellen mit dem CellTiter-Glo®-Assay beurteilt. Eine biologische Wiederholung pro Nanopartikelkonzentration bestand aus Dreifachversuchen (n = 3) und für Kontrollzellen aus Sechsfachversuchen (n = 6). Um die In-vitro-Dosissteigerung zu quantifizieren, wurde zunächst die Lumineszenz aus der Lebensfähigkeitsbewertung wie oben angegeben in die Anzahl der Zellen (#Zellen) übersetzt. Daraus wurde der überlebende Anteil SF der Zellen nach den Bestrahlungsdosisreaktionen von 0, 2, 4, 6 und 8 Gy berechnet als

Die Daten wurden dann mit MATLAB (MathWorks Inc., MA, USA) an das lineare quadratische Modell angepasst

Dabei ist D die Bestrahlungsdosis in Gy und α und β Anpassungsparameter. Der dosismodifizierende Faktor wurde ermittelt, indem die tödliche Dosis ermittelt wurde, die bei jedem Partikeltyp zu einem Überleben von 50 % (LD50 %) führt, und diese mit der Dosis ohne Nanopartikel verglichen wurde:

Die Scheinbestrahlungstoxizität von Nanopartikeln wurde definiert, indem die Anzahl der mit Nanopartikeln behandelten Zellen auf die Anzahl der Kontrollzellen normalisiert wurde, die ohne Nanopartikel behandelt und mit 0 Gy bestrahlt wurden:

Um in die DMR50 %-Analyse einbezogen zu werden, wurde für alle Nanopartikel ein Grenzwert für die Lebensfähigkeit der Zellen durch Scheinbestrahlung von 60 % (unterste Grenze) definiert. Eine Sigmoidkurve mit den Anpassungsparametern a und b in der Form

wurde an die Zelllebensfähigkeitsdaten angepasst, um Nanopartikel-LD50-Dosen (x) zu extrahieren.

Um die Aufnahme von Nanopartikeln in Zellen zu analysieren, wurden Zellen ausgesät und in Duplikaten auf die gleiche Weise wie in einem typischen Bestrahlungsexperiment behandelt. Nach 24-stündiger Nanopartikelbehandlung wurden die Zellen zweimal mit 250 µL PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen statt der Zugabe von Zellmedium mit Trypsin behandelt (80 µL). Die Trypsinierung wurde mit 220 µL Medium gestoppt und die Zellen wurden in Eppendorf-Röhrchen überführt und bis zur weiteren Analyse bei –20 °C gelagert. Um die Zellzahl zu ermitteln, wurden drei Versuchsvertiefungen mit Kontrollzellen gepoolt, 5 Minuten bei 200 × g zentrifugiert und mit einem Hämatozytometer gezählt. Dies wurde zweimal wiederholt. Vor der ICP-MS-Analyse wurden die Zellen in 1 ml HNO3, 3 ml HCl und 0,5 ml HF unter Verwendung einer einstündigen Badbeschallungsbehandlung verdaut. Nach dem Aufschluss wurden die Proben mit MilliQ-Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Für ICP-MS-Elementarstandardkurven wurden ionische Metallstandards (Au, Hf, W und Ti) in derselben Matrix wie die Proben in Konzentrationen von 0,01 bis 10 ppb hergestellt. Eine 1-ppb-Qualitätskontrolle (IV4 oder IV100, Inorganic Ventures, Christiansburg, VI, USA) diente als Referenz und stellte die Richtigkeit der Standardkurve sicher. Die Messungen wurden auf einem Agilent 7900 ICP-MS (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) durchgeführt. Nichtspektrale Interferenzeffekte wurden korrigiert, indem 100 ppb Sc, Ge, In und Lu online über ein T-Stück im Verhältnis 1:10 mit der Probe gemischt wurden. Alle Elemente wurden im Heliummodus gemessen. Die Elementmassen wurden dann auf die Zellzahl normiert und unter Verwendung des atomaren Massenanteils sowie der Nanopartikel-Schüttdichte weiter in den Nanopartikel-Volumenanteil umgerechnet, wie in Tabelle S1 der Zusatzinformationen angegeben. Der Nanopartikel-Volumenanteil wurde dann mithilfe der Scheinbestrahlungs-Lebensfähigkeitsanpassung aus der ergänzenden Abbildung 1 korrigiert. Das Volumen einer Zelle wurde als 2800 µm3 definiert, wobei der Durchmesser von 17,5 µm verwendet wurde, wie er von einem Coulter-Zähler ermittelt wurde. Die Beziehung zwischen der Metallmasse pro Zelle (f(x)) und der nominellen Nanopartikelkonzentration (x) wurde mithilfe einer nichtlinearen Anpassung mit den Anpassungsparametern A, B und p in der Form beschrieben

Um den Effekt der radialen Hydroxyllöschung während der Bestrahlung mit oder ohne Nanopartikel zu untersuchen, wurde vor 0 oder 6 steriles DMSO in Zellmedium in verschiedenen Konzentrationen (0, 0,11, 0,334, 0,667, 1 M) (in Vierfachbestimmungen, n = 4) zugegeben Gy-Bestrahlung und nach der Bestrahlung durch Zellmedium ersetzt, bevor die Zellen wieder in den Inkubator gegeben werden. Ähnlich wie bei den anderen Bestrahlungsexperimenten wurden zunächst 2000 Zellen in die inneren Vertiefungen von 48-Well-Platten ausgesät, 24 Stunden lang dort haften gelassen und den Vertiefungen Mediummischungen mit oder ohne vorbeschallte Nanopartikel zugesetzt. Auf jeder Platte wurde eine Kontrolle ohne Nanopartikel hinzugefügt. Die äußeren Vertiefungen der Platten wurden mit 500 µL sterilem PBS gefüllt, um in jeder Vertiefung die gleiche Luftfeuchtigkeit zu simulieren. Der Endwassergehalt wurde in allen Versuchsbrunnen auf 10 % festgelegt. Nach 24 Stunden wurden die Zellen wie üblich gewaschen, bevor DMSO-behandeltes Medium zugegeben wurde und eine 150-kVp-Röntgenbestrahlung stattfand. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde wie üblich 5 Tage nach der Bestrahlung analysiert. Der Grad des DMSO-Schutzes (DoP) wurde als Unterschied im nanopartikelbedingten Verstärkungseffekt mit und ohne DMSO definiert und wie folgt berechnet:

unter Verwendung der Überlebensfraktion SF von Zellen bei 6 Gy wie oben definiert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Research Reporting Summary.

Die Autoren erklären, dass die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, im Manuskript und seinen ergänzenden Informationsdateien verfügbar sind. Die Rohdaten der Monte-Carlo-Simulationen werden in diesem Artikel bereitgestellt. Verarbeitbare Rohdaten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

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Diese Studie wurde teilweise vom Schweizerischen Nationalfonds (Eccellenza-Stipendium Nr. 181290, IKH), der Krebsliga Schweiz (KFS-4868-08-2019, IKH) und einem ETH-Stipendium (ETH-07 21-2, IKH) finanziert ). Wir danken Prof. SE Pratsinis für den Zugang zur PTL-Infrastruktur, Ralf Kägi und Andreas Voegelin für den Zugang und Brian Sinnet für die Unterstützung in den HF-Aufschlussanlagen der Eidgenössischen Wasserwirtschaftsanstalt (EAWAG) und Pascal M. Gschwend für die Versorgung mit TiN-Nanopartikeln. Teile der Schaltpläne in der ergänzenden Abbildung 15a, b wurden mit BioRender.com erstellt.

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Lukas R. H. Gerken, Alexander Gogos, Fabian H. L. Starsich & Inge K. Herrmann

Abteilung für Radioonkologie, Kantonsspital St. Gallen (KSSG), Rorschacherstrasse 95, CH-9007, St. Gallen, Schweiz

Hans Schiefer & Ludwig Plasswilm

Center for Proton Therapy, Paul Scherrer Institute (PSI), Forschungsstrasse 111, 5232, Villigen PSI, Switzerland

Serena Psoroulas, David Meer und Damien C. Weber

Abteilung für Radioonkologie, Universitätsspital Bern (Inselspital), 3010, Bern, Schweiz

Ludwig Plasswilm & Damien C. Weber

Abteilung für Radioonkologie, Universitätsspital Zürich, 8091, Zürich, Schweiz

Damien C. Weber

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LRHG trug zum Studiendesign bei, führte Experimente und Simulationen durch, analysierte Daten und verfasste das Manuskript. AG entwickelte und führte Elementaranalyseprotokolle durch. FHLS half beim Design des ROS-Assays und der Nanopartikelsynthese. HD hat das ROS-Assay-Protokoll entwickelt. HD und MEG führten ROS-Experimente durch und synthetisierten Nanopartikel. HS, SP und DM halfen bei Bestrahlungsexperimenten und überprüften die Dosisversorgung während der Photonen- oder Protonenbestrahlung. DCW und LP lieferten Beiträge zu den Experimenten in den klinischen Bestrahlungsanlagen. Das IKH konzipierte und betreute die Studie und redigierte das Manuskript. Alle Autoren haben an der Erstellung des Manuskripts mitgewirkt und der endgültigen Fassung des Manuskripts zugestimmt.

Korrespondenz mit Inge K. Herrmann.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Nature Communications dankt Hélène Elleaume und den anderen anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

Open Access Dieser Artikel ist unter einer Creative Commons Attribution 4.0 International License lizenziert, die die Nutzung, Weitergabe, Anpassung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium oder Format erlaubt, sofern Sie den/die ursprünglichen Autor(en) und die Quelle angemessen angeben. Geben Sie einen Link zur Creative Commons-Lizenz an und geben Sie an, ob Änderungen vorgenommen wurden. Die Bilder oder anderes Material Dritter in diesem Artikel sind in der Creative Commons-Lizenz des Artikels enthalten, sofern in der Quellenangabe für das Material nichts anderes angegeben ist. Wenn Material nicht in der Creative-Commons-Lizenz des Artikels enthalten ist und Ihre beabsichtigte Nutzung nicht gesetzlich zulässig ist oder über die zulässige Nutzung hinausgeht, müssen Sie die Genehmigung direkt vom Urheberrechtsinhaber einholen. Um eine Kopie dieser Lizenz anzuzeigen, besuchen Sie http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Nachdrucke und Genehmigungen

Gerken, LRH, Gogos, A., Starsich, FHL et al. Katalytische Aktivität ist für die Erhöhung der Nanopartikeldosis in der Photonen- und Protonentherapie unerlässlich. Nat Commun 13, 3248 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-30982-5

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Eingegangen: 11. Februar 2022

Angenommen: 24. Mai 2022

Veröffentlicht: 06. Juni 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-30982-5

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