3D-Bioprinting macht die Imitationsmatrix real

An biotechnologisch hergestellten Geweben ist nichts Virtuelles – nehmen Sie also die rote und die blaue Pille

Im Labor der University of Florida unter der Leitung von Christine E. Schmidt, PhD, haben Wissenschaftler eine auf Apoptose basierende Methode verwendet, um Rattenlungen zu dezellularisieren und die extrazelluläre Matrix (ECM) zu erhalten. Die Wissenschaftler beabsichtigen, ECM-Hydrogele zu rezellularisieren, um Modelle für Lungenerkrankungen zu erstellen. Diese 3D-Projektion zeigt Lungenepithelzellen von Ratten, die in Lungen-ECM-Hydrogelen kultiviert wurden (grün: lebende Zellen; rot: tote Zellen).

Die extrazelluläre Matrix (ECM) ist ein dreidimensionales (3D) Netzwerk aus Makromolekülen – wie Kollagen, Enzymen und Glykoproteinen – das für die räumliche Orientierung, Interaktion und Signalübertragung zwischen umgebenden Zellen unerlässlich ist. Bei der Entwicklung von ECM geht es darum, natürliche Gewebeumgebungen nachzuahmen, Einblicke in die Matrix-gesteuerte Zellregulation zu gewinnen und darüber hinaus Ersatz für beschädigte Organe zu entwickeln.

Nachgeahmtes ECM wird durch 3D-Biodruck zum Leben erweckt. Als Erweiterung des traditionellen 3D-Drucks ist der 3D-Biodruck eine additive Fertigungstechnologie, die Biomaterialien – Zellen, Wachstumsfaktoren und vernetzbare Gerüstkomponenten – in Anordnungen ablagert, die die Bildung gewebeähnlicher Strukturen begünstigen. Der 3D-Biodruck entwickelt sich zu einem leistungsstarken Werkzeug für die regenerative Medizin, da er in der Lage ist, optimale physikalische und biochemische Eigenschaften für Zelladhäsion, Migrationsproliferation und Differenzierung zu vereinen.

3D-biogedruckte Modelle besetzen eine einzigartige Nische in der Forschungsgemeinschaft und bieten eine streng kontrollierte Integration der unterstützenden Matrix mit relevanten Zelltypen. „Wenn wir ein synthetisches Blutgefäß schaffen wollten, würden wir Endothelzellen auf einen der hoch biokompatiblen Biotinten aussäen, die aus Gelatine, Fibrin, Alginat oder anderen natürlichen Materialien gewonnen werden“, sagt Akhilesh K. Gaharwar, PhD, ein Mitarbeiter Professor für Biomedizintechnik an der Texas A&M University.

Gaharwars enger Mitarbeiter, Abhishek Jain, PhD, Assistenzprofessor für Biomedizintechnik an der Texas A&M, unterstreicht diesen Punkt: „3D-Bioprinting könnte die Gefäßanatomie eines Patienten präzise reproduzieren, einschließlich personalisierter Geometrien aus CT-Scans.“ Durch die Schichtung einer Polymermatrix und zellulärer Gemeinschaften erhöhen wir schrittweise die Komplexität des Systems und bewirken, dass sich Zellen auf physiologisch relevante Weise ausrichten, interagieren und reagieren.“

Gaharwar und Jain glauben, dass die Modellierung des komplexen Gefäßsystems zu besseren Behandlungen von Gefäßerkrankungen führen könnte. Es wird erwartet, dass Gefäßerkrankungen, die jedes Jahr über 17 Millionen Todesfälle verursachen, in naher Zukunft epidemische Ausmaße annehmen werden.

Ein komplexes Gefäßsystem lässt sich in vitro nur schwer reproduzieren, da es aus einer vielschichtigen Zellarchitektur besteht. Diese Architektur entspricht nicht nur den grundlegenden Gefäßstrukturen (Gefäßen, die aus inneren und äußeren Zellschichten bestehen), sondern unterstützt auch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Gefäßzellen und der umgebenden Mikroumgebung.

„Mit 3D-Bioprinting lässt sich ein Modell erstellen, das mechanische Eigenschaften wie Entspannung und Kontraktion der Wände sowie physiologische Eigenschaften wie Endothelaktivierung, Gerinnselbildung und andere wichtige Krankheitsmerkmale nachbilden kann“, fügt Jain hinzu. „Unsere Labore arbeiten an einer neuen Familie von Biotinten, die nach der Extrusion eine hohe Formtreue und nach der Vernetzung eine hohe mechanische Stabilität beibehalten.“

Durch die Vernetzung entsteht ein Hydrogel, und das Hydrogel wird mit scheibenförmigen Nanosilikat-Nanopartikeln kombiniert, die dem gedruckten Konstrukt Festigkeit verleihen und sich elektrostatisch an geladene Polymere binden. Der Einbau von Nanosilikaten in Hydrogele verbessert die Fließeigenschaften von Vorläuferlösungen des Druckerzeugnisses erheblich. Folglich entsteht durch die Vernetzung gedruckter Vorläufer mit UV-Licht eine einzigartig starke, aber elastische Matrix, die für Pfropfverfahren geeignet ist.1

„Unser Ziel ist es, die Entdeckung von Medikamenten zu beschleunigen, indem wir ein voll funktionsfähiges Blutgefäß mit primären menschlichen Gefäßzellen schaffen“, erklärt Gaharwar. „[Wir hoffen], die interzelluläre Kommunikation während Krankheitsprozessen auf einem beispiellosen Niveau zu erforschen.“

Bausteine ​​für biotechnologisch hergestellte Gewebe werden an der University of Illinois in Chicago in einem Labor unter der Leitung von Eben Alsberg, PhD, Richard und Loan Hill Professor für Bioingenieurwesen und Orthopädie, in Zusammenarbeit mit Oju Jeon, PhD, Forschungsprofessor für Bioingenieurwesen, entwickelt. Die Bausteine ​​sind mikroskalige Hydrogele oder Mikrogele und können verschiedene Zelltypen und/oder bioaktive Faktoren enthalten. Sie sind so konzipiert, dass sie den Zusammenbau komplexer Strukturen im LEGO-Stil von unten nach oben ermöglichen.2

Um die gewünschte Architektur zu entwickeln, werden Mikrogele an vordefinierten Stellen in ein Gelatine-Aufschlämmungsbad gedruckt. Die Gelatineaufschlämmung hilft, die eingebetteten Mikrogelpositionen zu stabilisieren. Anschließend werden die Mikrogele durch Licht miteinander vernetzt. Wenn die Aufschlämmung weggeschmolzen ist, bleibt das photovernetzte Mikrogelkonstrukt intakt; das heißt, die ursprüngliche gedruckte Geometrie bleibt erhalten. Die Schlammbad-Drucktechnik, die als Freeform Reversible Embedding of Suspension Hydrogels (FRESH) bezeichnet wird, wurde von Adam W. Feinberg, PhD, Professor für Materialwissenschaft und -technik sowie Biomedizintechnik an der Carnegie Mellon University, entwickelt.

„Wir haben FRESH eingesetzt, um den Aufbau ionisch vernetzter Alginat-Mikrogele zu unterstützen, die nach der Bildung der gewünschten Architekturen zusätzlich photovernetzt werden“, erklärt Alsberg. „Wir haben gezeigt, dass die mit Stammzellen besiedelten Mikrogele zur Langzeitlagerung eingefroren und zu einem späteren Zeitpunkt aufgetaut werden können, während die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten bleibt.“

„Kryokonservierte Mikrogele könnten in den Operationssaal gebracht, kurz aufgetaut und dann vor Ort gedruckt werden“, fährt er fort. „Mit der Zeit würde sich das Mikrogelmaterial zersetzen, da neu entwickeltes Gewebe den verletzten Bereich füllte.“

Die Plug-and-Play-Eigenschaften des Mikrogel-Bioinks sind besonders vorteilhaft für die Erzeugung komplexer Strukturen wie Blutgefäße oder Knochen-Knorpel-Grenzflächen. Das Team macht weitere Fortschritte beim rein zellulären Drucken und hofft, die während der Entwicklung und Heilung ablaufenden zellulären Selbstorganisationsprozesse teilweise nachbilden zu können.

„Dies wäre beispielsweise bei Knorpelreparaturanwendungen von Vorteil, bei denen Zellen bekanntermaßen während der frühen Chondrogenese auf natürliche Weise aggregieren“, schlägt Alsberg vor. „Zellkondensation spielt eine entscheidende Rolle bei der Schaffung einer geeigneten Mikroumgebung für die chondrogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen. Wir glauben, dass die Beseitigung physischer Biomaterialbarrieren zwischen Zellen in einem 3D-Bioprint-Konstrukt ein völlig neues Paradigma auf diesem Gebiet ist.“3

Physikalische, chemische und biologische Mikroumgebungen haben einen direkten Einfluss auf das Zellverhalten. „Wir postulierten, dass die mechanischen und räumlichen Eigenschaften von 3D-gedruckten Gerüsten die Zellaggregation oder -morphologie erheblich beeinflussen könnten“, sagt Stephen J. Florczyk, PhD, Assistenzprofessor für Materialwissenschaft und -technik an der University of Central Florida. „3D-Druckverfahren erzeugen relativ glatte Oberflächen.“ Diese Oberflächen sind ausreichend flach – auf zellulärer Ebene etwa zweidimensional –, dass sie unterschiedliche zelluläre Verhaltensweisen auslösen. Laut Florczyk verteilen sich Zellen auf ebenen Oberflächen völlig anders als auf porösen, dreidimensionalen Oberflächen.

Florczyk und Kollegen stellten fest, dass in kommerziellen 3D-gedruckten Polycaprolacton-Matrizen die einzigen Poren Makroporen sind, denen die feinen Strukturmerkmale fehlen, die zur Unterstützung der Matrix-Zell-Wechselwirkungen erforderlich sind. Das Team machte sich daran, die Porosität in künstlichen Gerüsten wiederherzustellen, indem es zwei bekannte Techniken kreativ kombinierte: FRESH (bereits beschrieben) und Gefrierguss.

Der Gefrierguss, auch Gefriertrocknung oder Eistemplatierung genannt, ist im Bioprinting immer noch auf dem Vormarsch, in der Industrie ist er jedoch eine etablierte Methode, wo er zur Herstellung poröser Materialien eingesetzt wird. Beim Gefrierguss bilden sich Eiskristalle innerhalb eines geformten Materials. Durch die Sublimation von Eis durch Gefriertrocknung entstehen Poren, die etwa die Größe ehemaliger Eiskristalle haben.

Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die endgültigen Mikro- und Makrostrukturen von gefriergegossenen Gerüsten zu kontrollieren. Florczyk und Kollegen nutzten ihr Wissen über diese Methoden und entwickelten die Freeze-FRESH (FF)-Technik, bei der ECM-Gerüste in einer Gelatineaufschlämmung gedruckt und eingefroren werden, um Poren in gedruckten Streben zu bilden.

Das Florczyk-Team hat die Materialeigenschaften von FF-Gerüsten akribisch analysiert. Anschließend verglichen die Wissenschaftler diese Eigenschaften mit denen konventionell biogedruckter, gefriergegossener und kommerziell erhältlicher Biomatrizen. Die Wissenschaftler beobachteten, dass die FF-Gerüste Mikro- und Makroporen entwickelten, die mehr als das Zehnfache der Strebenporosität der herkömmlich biogedruckten Alginate erreichten.

„Bemerkenswerterweise erhöhte der Gefrierprozess auch die Widerstandsfähigkeit der resultierenden FF-Gerüste“, bemerkt Florczyk. „Wir stellen uns vor, dass FF-Materialien durch die Mischung mit Zusatzstoffen wie Keramik zu verschiedenen Knochenstrukturen geformt werden könnten, deren mechanische Eigenschaften denen von Knochen nahekommen.“

Das Team verfolgt derzeit jedoch eine andere Anwendung: die Modellierung der Tumormikroumgebung. Die kontrollierte Analyse der Signale aus der Mikroumgebung des Tumors ist eine Herausforderung, aber für das Verständnis der Metastasierung und des Krankheitsverlaufs unerlässlich. Die ECM durchdringt den Tumor und sorgt für strukturelle Integrität und biochemische Signalübertragung.

Das Team hat bereits vorläufige Daten gesammelt, die eine erhöhte Zellproliferation und Clusterbildung auf FF-Matrizen belegen. Das Team glaubt, dass FF-Gerüste präzise manipuliert werden könnten, um einer heterogenen Tumormikroumgebung zu ähneln.

„Ein großer Teil der Biomaterialindustrie konzentriert sich auf die Verwendung von Dentalpolymeren – vor allem auf die Herstellung von Zahnersatz“, sagt Praveen R. Arany, PhD, Assistenzprofessor für Oralbiologie und Biomedizintechnik an der University at Buffalo. „Die Zahnmedizin war schon immer Vorreiter bei der klinischen Verwendung synthetischer Materialien. Darüber hinaus ist die stuhlseitige Zahnheilkunde wirklich ausgereift und ermöglicht die individuelle Herstellung von Restaurationen auf Polymerbasis innerhalb weniger Stunden.“

Laut Arany werden subtraktive (oder fräsende) 3D-Techniken zur Herstellung von Prothesen in naher Zukunft wahrscheinlich durch additive Technologien wie gedruckte Prothesen weiter verbessert. Ein einzigartiger Vorteil additiver Techniken ist die Fähigkeit, gedrucktes Material zu funktionalisieren. Während beim Gewebe-Bioprinting Zellen in das Matrixmaterial integriert werden, könnten beim Drucken von Dentalgeräten Chemikalien (Farben) oder Medikamente (Antibiotika und Biologika) enthalten sein.

Aranys Labor hat die Möglichkeit untersucht, 3D-gedruckte Zahnprothesen herzustellen, die ein Antimykotikum, Amphotericin B, einkapseln. Mehr als 65 % der Bevölkerung, die Zahnprothesen trägt, sind von Candida-Infektionen im Zusammenhang mit Zahnprothesen betroffen.4 Die Besiedlung von Zahnprothesen durch Pilz- und Bakterienbiofilme ist bekanntermaßen schwierig entfernen, da sich die Organismen in die äußere Schicht aus Polymethylmethacrylat (PMMA) einnisten.

„Wir haben uns dafür entschieden, ein bekanntes Paradigma medikamentenfreisetzender Stents nachzuahmen“, erinnert sich Arany. „Unsere Ergebnisse zeigten, dass, wenn antibiotische Mikrokügelchen in die äußere Schicht von gedrucktem Zahnersatz eingearbeitet werden, der Wirkstoff kontinuierlich freigesetzt wird, wenn das Oberflächenmaterial abgebaut wird.“

Um eine antibiotische Mikrosphärentechnologie mit klinischem Potenzial zu entwickeln, optimierte das Arany-Labor die Konzentrationen der in Mikrosphären eingekapselten Arzneimittel und die Dichte der Mikrosphären. Antimykotischer Zahnersatz ist der anfängliche Schwerpunkt von OptiMed Technology, einem Biotechnologie-Startup-Unternehmen, das aus dem Universitätslabor von Arany hervorgegangen ist und seinen Hauptsitz in Buffalo, NY, hat. Das OptiMed-Team prüft bereits verschiedene andere Anwendungen.

„Speichel ist eine eher unterschätzte Körperflüssigkeit“, betont Arany. „Wenn bestimmte Gesundheitsprobleme auftreten, gelangen Moleküle, die mit diesen Krankheiten in Zusammenhang stehen, vom Serum in den Speichel. 3D-gedruckte Dentalgeräte eignen sich hervorragend zur Unterstützung der Speicheldiagnostik. Stellen Sie sich vor, Ihr Zahnersatz könnte den Glukosespiegel messen und Daten an den behandelnden Arzt senden.“

Darüber hinaus könnten Sense-and-Response-Biomaterialien sowohl zur Diagnose als auch zur Behandlung von Krankheiten beitragen. Solche Materialien könnten beispielsweise so gestaltet sein, dass sie Medikamente bei Bedarf freisetzen. Wenn eine Infektion einsetzt, ändert sich der pH-Wert auf der Prothesenoberfläche, wodurch „intelligente“ funktionalisierte Dentalmaterialien aktiviert werden, um die Wirkstofffreisetzung einzuleiten. Arany stellt sich eine Auswahl stimuliresponsiver biologischer Nutzlasten in Zahnimplantaten, chirurgischen Ligaturen und sogar zahnärztlichen Instrumenten vor.

Dezellularisierte Gewebe drängen in eine Vielzahl von Gesundheitsanwendungen, indem sie Gerüste für die Geweberegeneration bereitstellen. Azelluläre Transplantate reduzieren die Notwendigkeit einer autologen Gewebeentnahme vom Patienten und minimieren das Risiko einer Immunabstoßung.

Wenn ein Gewebe dezellularisiert wird, werden die Zellen, die die ECM bewohnen, entfernt, während die ECM selbst erhalten bleibt. „Unser Labor war eines der ersten, das über eine auf Apoptose basierende Technik zur Zellentfernung berichtete“, behauptet Young Hye Song, PhD, leitender Wissenschaftler im Labor der University of Florida unter der Leitung von Christine E. Schmidt, PhD, Pruitt Family Professorin und Vorsitzende des Fachbereichs Biomedizinische Technik. Song weist darauf hin, dass der Ansatz des Schmidt-Labors Zellen sanfter entfernt als eine übliche Alternative, die Verwendung scharfer Reinigungsmittel. Laut Song verändern scharfe Reinigungsmittel bekanntermaßen die Gewebestruktur und könnten das Regenerationspotenzial der Transplantate verringern.

Das Team behandelt Gewebe mit Camptothecin, einem häufigen Zytotoxin, von dem bekannt ist, dass es in Zellen Apoptose auslöst. Anschließend entfernt das Team Rückstände mit milden hypertonischen und isotonischen Puffern.

Das Schmidt-Labor berichtet, dass es bedeutende Erfolge bei der Dezellularisierung von Nerven- und Lungengewebestrukturen erzielt hat und den Erhalt des Kollagen- oder Glucosaminoglykangehalts gezeigt hat. Song erklärt, dass die genaue Zusammensetzung von ECM noch erforscht wird. Folglich ist es ziemlich schwierig, ECM durch Mischen einzelner Komponenten zu reproduzieren.

„In Zukunft“, so Song, „könnte uns eine detaillierte molekulare Analyse dezellularisierter ECM der Entwicklung von ECM-Mischungen für personalisierte Medizinanwendungen näher bringen.“ Das ultimative Ziel besteht darin, durch Aufschluss von ECM mit Säure-Enzym-Präparaten eine injizierbare Lösung aus azellulärem Transplantatgewebe zu erhalten.

Die Transplantatimplantation ist ein komplexer Eingriff und erfordert für eine optimale Transplantatintegration die Entfernung von gesundem Gewebe. Injizierbare Formulierungen hingegen könnten eine weniger invasive Option zur Überbrückung von Gewebeläsionen bieten. Rasterelektronenmikroskopie ergab, dass ECM-Hydrogele unter physiologischen Bedingungen Fasern mit einem Durchmesser von etwa 100 nm bilden. Das Gel könnte direkt in lebende Organismen injiziert werden, um Gerüste für das Gewebewachstum zu schaffen.

„Zu unseren zukünftigen Schwerpunkten in der Lungenforschung gehört die Rezellularisierung von Hydrogelen mit Gefäß- und Atemwegsepithelzellen“, bietet Song an. „Wir könnten Mikroumgebungen wiederherstellen, die bei Lungenerkrankungen wie der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung häufig vorkommen, und wirksame Therapien entwickeln, ohne dass eine Lungentransplantation erforderlich wäre.“

Referenzen1. Gold K, Gaharwar AK, Jain A. Neue Trends in der Multiskalenmodellierung der Gefäßpathophysiologie: Organ-on-a-Chip und 3D-Druck. Biomaterialien 2019; 196: 2–17. 2. Jeon O, Lee YB, Hinton TJ, Feinberg AW, Alsberg E. Kryokonservierter zellbeladener Alginat-Mikrogel-Bioink für den 3D-Biodruck lebender Gewebe. Mater. Heute Chem. 2019; 12: 61–70,3. Jeon O, Lee YB, Jeong H, Lee SJ, Alsberg E. Biotinte nur für lebende Zellen und photohärtbares Trägermedium zum Drucken und Erzeugen technischer Gewebe mit komplexen Geometrien. bioRxiv 2019.4. Nagrath M, Sikora A, Graca J, Chinnici JL, Rahman SU, Reddy SG, Ponnusamy S, Maddi A, Arany PR. Funktionalisierte prothetische Schnittstellen mittels 3D-Druck: Generierung infektionsneutralisierender Prothesen in der Zahnheilkunde. Mater. Heute Komm. 2018; 15: 114–119.