Redox-Signale induzieren das ribosomale Laminin-Rezeptor-Protein

Wissenschaftliche Berichte Band 12, Artikelnummer: 7742 (2022) Diesen Artikel zitieren

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Aktuelle Biomaterialien ersetzen effektiv biologische Strukturen, sind jedoch durch Infektionen und langfristige Materialausfälle eingeschränkt. Diese Studie untersuchte die molekularen Mechanismen von Hochfrequenz-Glimmentladungsbehandlungen (RFGDT) bei der Vermittlung der Desinfektion von Biomaterialoberflächen und der gleichzeitigen Förderung der Zellanhaftung und -proliferation. Dentale Biomaterialien wurden RFGDT unterzogen und die Lebensfähigkeit oraler mikrobieller Spezies, nämlich Streptococcus-Mutanten (SM), Streptococcus gordonii (SG), Moraxella catarrhalis (MC) und Porphyromonas gingivalis (PG), wurde bewertet. Die Zellanhaftung und das Überleben einer Präodontoblasten-Zelllinie, MDPC-23, wurden untersucht. Abschließend wurden mechanistische Untersuchungen zur Redoxerzeugung und biologischen Signalübertragung untersucht. Basierend auf ihrer Zusammensetzung induzierten Zahnbiomaterialien nach dosisabhängiger RFGDT reaktive Sauerstoffspezies (ROS). Eine verringerte mikrobielle Lebensfähigkeit war nach RFGDT bei den Katalase-negativen (SM und SG) Spezies stärker ausgeprägt als bei den Katalase-positiven (MC und PG) Spezies. Zelladhäsionstests ergaben eine verbesserte Bindung und Überlebensrate von MDPC-23. Vorbehandlungen mit N-Acetylcystein (NAC) und Katalase hoben diese Reaktionen auf. Immunoassays stellten nach RFGDT eine redoxinduzierte Downstream-Expression eines Lamininrezeptors, Ribosomal Protein SA, fest. Somit vermittelt RFGDT-induziertes Redox eine antimikrobielle Wirkung und verbessert Zellreaktionen wie Adhäsion und Proliferation. Diese Beobachtungen liefern zusammen eine mechanistische Begründung für den klinischen Nutzen von RFGDT mit zahnmedizinischen Biomaterialien für regenerative klinische Anwendungen.

Biomaterialien haben es dem Tissue Engineering ermöglicht, sich von einer aufstrebenden Wissenschaft zu seiner aktuellen Schlüsselrolle als Vorreiter der klinischen regenerativen Medizin zu entwickeln1,2,3. Diese Biomaterialsysteme wurden in verschiedenen klinischen Bereichen für ästhetische und funktionelle Ersetzungen problemlos übernommen. Bei Biomaterialsystemen wurden enorme Fortschritte erzielt, von passiven, biokompatiblen Trägern oder inerten Ersatzstoffen bis hin zu aktuellen bioaktiven oder intelligenten Systemen, die über Wahrnehmungs- und Reaktionsfähigkeiten verfügen4,5. Fortschritte in diesen Bereichen umfassten unter anderem neuere Zusammensetzungen, optimierte nanotopologische Merkmale, biophysikalisch aktivierte und kontrolliert freisetzende Biomaterialsysteme. Diese Fortschritte sind eng mit Fortschritten in der Entwicklung und Stammzellbiologie verbunden und ermöglichen ein kritisches Verständnis der Zellregulation während der Gewebeheilung und -regeneration6,7,8. Dazu gehören intrinsische Regulation mit wichtigen Transkriptionsfaktoren, Genorganisation, Signalgebung, Metabolomik und extrinsische Regulation mit Membran, nanoskaliger Ligandenbindung und parakriner Signalgebung. Darüber hinaus ist unter diesen extrinsischen Faktoren die Rolle der Metagenomik der allgegenwärtigen Mikrobiota jetzt besser verstanden, was die Notwendigkeit einer wirksamen Desinfektion weiter unterstreicht9,10,11,12,13.

Die Mundhöhle stellt aufgrund ihrer biologischen Weich- und Hartgewebebestandteile mehrere einzigartige Herausforderungen dar. Diese oralen Gewebe stellen eine exklusive anatomische Nische dar, in der hartes Gewebe (Zähne) durch weiches Gewebe (Gingiva) über eine empfindliche, aber strenge Schnittstelle freigelegt wird. Die Bedeutung eines gesunden oralen Mikrobioms und die Auswirkungen von Dysbiose auf die orale und systemische Gesundheit sind gut belegt14,15,16. Diese Aspekte stellen aufgrund der ständigen biomechanischen, mikrobiologischen Angriffe und immunologischen Überwachung in der Mundumgebung erhebliche Herausforderungen für den Ersatz von Biomaterialien dar. Die Kombination aus körperlichem Stress, mikrobiologischen und vom Wirt stammenden Enzymen, Infektionen und Abbaunebenprodukten kann synergetisch zum Versagen von Biomaterialien beitragen17,18. Nichtsdestotrotz werden in der Zahnheilkunde Keramik, Metall, Polymere und deren Kombinationen sehr effektiv als Restaurationen, Prothesen oder Implantate eingesetzt, die ein wesentlicher Bestandteil der aktuellen klinischen Versorgung sind. Neuere Technologien wie digitale Abdrücke, hochauflösende Kegelstrahl-Computertomographie (CBCT), subtraktiver und additiver 3D-Druck haben die Weiterentwicklung des Gerätedesigns beschleunigt und die Produktionszeit verkürzt, was eine stuhlseitige Fertigung ermöglicht19. Diese Fortschritte bei maßgeschneiderten Geräten aus Biomaterial unterstreichen die Notwendigkeit, praktische Desinfektionstechniken für die Praxis zu erforschen.

Ein idealer Ansatz muss eine Desinfektion unmittelbar vor der klinischen Verwendung ermöglichen und darf die physikalische oder chemische Materialleistung nicht beeinträchtigen, während gleichzeitig die Biomaterialschnittstelle optimal vorbereitet wird, um günstige biologische Reaktionen des Wirts zu fördern20,21. Es wurden verschiedene Desinfektionsansätze eingesetzt, darunter trockene und feuchte Hitze, chemische Desinfektion und biophysikalische Mittel wie Ultraviolett, Ethylendioxidgas, Kohlendioxid, Ultraschall, Plasma und Mikrowellen22,23. Aufgrund ihrer Geräteeigenschaften sind einige dieser wirksamen Desinfektionsquellen auf die kommerzielle Produktion beschränkt und für den routinemäßigen klinischen Einsatz unpraktisch. Die Erzeugung von Plasma durch Glimmentladung erfolgt durch die Ionisierung gasförmiger Moleküle, die als Townsend-Lawine oder -Entladung bezeichnet wird24,25. Dieser Prozess kann bei atmosphärischem und niedrigem Druck erleichtert werden, was zu einem nicht-thermischen Prozess führt, der die Zieloberflächen nur minimal verändert. Zur Erzeugung von Glimmentladungsplasma wurden mehrere Energiequellen verwendet, beispielsweise Gleichstrom, Elektronenzyklotronresonanz und Hochfrequenz. Unter anderem ist die Hochfrequenz-Glimmentladungsbehandlung (RFGDT) in der Lage, ein großes Volumen gleichmäßig geladenen Plasmas zu erzeugen, das sowohl durch leitende (Metall) als auch nicht leitende (Polymere) Biomaterialien fließen kann26,27. RFGDT-erzeugtes Plasma entfernt in Gegenwart von Luft oder Sauerstoff organische Verunreinigungen durch die Erzeugung hochreaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die die Oberflächenoxidation und -hydroxylierung fördern28. Es wurde auch festgestellt, dass RFGDT eine hohe Oberflächenenergie erzeugt, die die Hydrophilie erhöht und die Zellausbreitung und -anhaftung erleichtert27,29,30. Der genaue Mechanismus, der diese verbesserte Zelladhäsion nach RFGDT vermittelt, ist jedoch nicht geklärt. Diese Studie untersuchte die Auswirkungen von RFGDT auf verschiedene Zahnbiomaterialoberflächen. Bewertet wurden die gleichzeitigen Auswirkungen auf die Desinfektion von vier häufig vorkommenden oralen Mikroben und die gleichzeitigen Veränderungen der Zelladhäsion und -proliferation in einer oralen Zelllinie, MDPC-23. Schließlich untersuchten biochemische und molekulare Tests den genauen biologischen Mechanismus, der die zellulären Reaktionen vermittelt.

Das durch RFGDT erzeugte Plasma beeinflusst die Oberflächenchemie der Biomaterialien basierend auf ihrer Zusammensetzung und dem Vorhandensein exogener Gase. Da die Zahnpulpa verschiedenen restaurativen Biomaterialien wie Glasionomerzement, Polymeren und Metallen ausgesetzt ist, untersuchten wir die Entstehung von Redoxspezies nach RFGDT mit einem Chemilumineszenz-Luminol-Assay31. RFGDT erzeugte einen signifikanten Anstieg der ROS auf Glas- (Abb. 1a) und Platinoberflächen (Abb. 1b), während auf einer Polymeroberfläche (Polymethylmethacrylat, PMMA) eine minimale Expression festgestellt wurde (Abb. 1c). RFGDT induzierte einen dosisabhängigen Anstieg der Redoxerzeugung, wobei das Optimum bei 180 s festgestellt wurde (Abb. 1d). Da in einer früheren Studie verschiedene Oberflächenbehandlungen wie Reinigungsmittel, Alkohol oder Silan verwendet wurden, stellten wir fest, dass nur RFGDT Redox erzeugt (Abb. 1e)27. Diese Ergebnisse zeigen, dass, während mehrere Wirkstoffe Biomaterialschnittstellen desinfizieren können, die Induktion von RFGDT-induziertem Redox die mikrobielle Besiedlung dauerhaft verhindern und gleichzeitig die Wechselwirkungen mit Wirtszellen günstig modulieren kann.

RFGDT erzeugt Redox auf Biomaterialoberflächen. Die ROS-Erzeugung wurde mit dem Luminol-Chemilumineszenz-Assay unmittelbar nach RFGDT mit verschiedenen Biomaterialien bewertet, nämlich (a) Glas, (b) Metall und (c) Polymer; (d) Die ROS-Erzeugung wurde auch nach unterschiedlichen Behandlungszeiten mit RFGDT bewertet. (e) Mit ODS, Alkohol oder RFGDT vorbehandelte Glasoberflächen wurden mit dem Luminol-Assay bewertet.

Um das Desinfektionspotenzial von RFGDT zu untersuchen, untersuchten wir zunächst das endogene Antioxidans, indem wir einzelne Mikroben mit Wasserstoffperoxid inkubierten. Wir stellten fest, dass Streptococcus gordonni- und Streptococcus-Mutanten, die Katalase-negativ sind, kein Aufschäumen erzeugten (Abb. 2a). Im Gegensatz dazu erzeugten Moraxella catarrhalis und Porphyromonas gingivalis, die Katalase-positiv sind, ein starkes Aufschäumen, was auf die aktive Fähigkeit zur ROS-Neutralisierung hinweist. RFGDT-behandelte Glasdeckgläser wurden mit S.-Mutanten besät und zeigten im Lebend-Tot-Assay eine verringerte Lebensfähigkeit (Abb. 2b). In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung waren die koloniebildenden Einheiten (KBE) von S. mutants (Abb. 2c) und S. gordonni (Abb. 2d) nach RFGDT signifikant reduziert. Die Verringerung des mikrobiellen Überlebens könnte durch Vorinkubation mit den ROS-Fängern N-Acetylcystein (NAC) und Katalase verhindert werden. In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen wurden keine Unterschiede in den KBE bei M. catarrhalis (Abb. 2e) und P. gingivalis (Abb. 2f) beobachtet, die nach RFGDT auf Glasdeckgläsern ausgesät wurden. Diese Ergebnisse zeigen, dass RFGDT-induziertes Redox die Lebensfähigkeit und Proliferation anfälliger (Katalase-negativer) Mikroben verringert, während anaerobe, Katalase-positive Arten resistent waren.

Antimikrobielle Wirkung von RFGDT. (a) Vier Bakterienarten wurden Wasserstoffperoxid ausgesetzt und das Aufschäumen wurde beurteilt; (b) Der bakterielle Lebensfähigkeitstest mit TTC-Assay wurde mit S. mutans nach RFGDT durchgeführt. Koloniebildungstests wurden mit vier Bakterienarten nach RFGDT durchgeführt, nämlich (c) Streptococcus-Mutanten, (d) Streptococcus gordonni, (e) Moraxella catarrhalis (f) Porphyromonas gingivalis. In einigen Fällen wurde eine Inkubation mit N-Acetylcystein oder Katalase durchgeführt, gefolgt von RFGDT. n = 3, *p < 0,05. RFGDT: Radiofrequenz-Glimmentladungsbehandlung; NAC: N-Acetylcystein; KBE: Koloniebildende Einheiten.

Die Zelladhäsion an das Substrat ist entscheidend für die Anheftung und anschließende Proliferation. Mehrere Biomaterialien, wie z. B. Zahnzemente und Verbundwerkstoffe, enthalten Glas oder Metalle, die direkt mit den Zellen der Zahnpulpa in Kontakt kommen. Daher untersuchten wir als nächstes die Auswirkungen von RFGDT auf eine Prädodontoblastenzelllinie von Säugetieren, MDPC-23. Glasdeckgläser wurden vor dem Impfen einem Reinigungsmittel, Alkohol, Silan (ODS) oder RFGDT ausgesetzt. Wir untersuchten sowohl schwache als auch starke Zelladhäsionen, indem wir die durch Basal- und Zentrifugalkraft induzierten adhärenten und schwimmenden Zellpopulationen 5 und 24 Stunden nach der Zellaussaat beurteilten. Wir beobachteten eine maximale Anzahl adhärenter Zellen bei der RFGD-Behandlung, während die meisten Zellen auf ODS- und alkoholbehandelten Oberflächen nicht adhärent waren (Abb. 3a, b). Die Zeitverlaufsanalyse nach 5 und 24 Stunden mit den Adhäsionsstärketests bestätigte diese Beobachtung weiter bei mit Silan und Alkohol behandelten Oberflächen und zeigte, dass die meisten nicht anhaftenden Zellen im Gegensatz zu RFGDT eine optimale Biomaterialschnittstelle für überwiegend starke Zelladhäsion boten (Abb. 3c). –e). Der ausgeprägte Anstieg nicht anhaftender Zellen in der mit Alkohol behandelten Gruppe nach 5 Stunden könnte auf einen anhaltenden Wirkstoffrest zurückgeführt werden, der die Lebensfähigkeit der Zellen verringert. Schließlich wurde festgestellt, dass die Inkubation mit N-Acetylcystein oder Katalase die durch RFGDT verbesserte Zellanhaftung spezifisch reduziert (Abb. 3f). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die verbesserte Zelladhäsion nach RFGDT durch redoxvermittelte Signalübertragung vermittelt wird.

Zelladhäsion nach RFGDT. (a) MDPC-23-Zellen wurden auf diesen Oberflächen ausgesät und mikroskopisch beurteilt; (b) Die Zellanhaftung an verschiedenen behandelten Biomaterialoberflächen wurde durch Zellzählung beurteilt. (c) Mit Zellen besäte Oberflächen wurden niedrigen Zentrifugalkräften (2400 U/min) ausgesetzt, um schwache Zelladhäsionen nach 5 Stunden zu bestimmen; (d) Mit Zellen besäte Oberflächen wurden hohen Zentrifugalkräften (4000 U/min) ausgesetzt, um starke Zelladhäsionen nach 5 Stunden und (e) nach 24 Stunden zu bestimmen. (f) Die starke Zelladhäsion wurde mit Glasoberflächen bewertet, die vor RFGDT mit NAC, Katalase oder Wasserstoffperoxid vorbehandelt wurden. Alle Studien, n = 3, *p < 0,05. RFGD: Radiofrequenz-Glimmentladung; ODS: n-Octadecyltrichlorsilan; RFUs: Relative Fluoreszenzeinheiten; NAC: N-Acetylcystein.

Bei der Zelladhäsion handelt es sich um konzertierte Aktionen mehrerer Zellmembran- und Zytoplasmamoleküle, die in der Lage sind, dynamisch einen Bindungskomplex aufzubauen31,32,33. Unter diesen verschiedenen Mediatoren wurde gezeigt, dass Lamininrezeptoren auf der Zelloberfläche eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung von Matrixinteraktionen spielen37. Die Aufklärung dieser Adhäsionskomplexe hat auch mehrere vorgeschaltete Signalmediatoren aufgezeigt, die die Rolle eines Lamininrezeptors, Ribosomal Protein SA (RPSA), beschreiben, der durch Redoxsignale induziert wird34,35. Um die Auswirkungen des Redoxsignals auf die Zelladhäsion zu untersuchen, wurden MDPC-23-Zellen daher mit verschiedenen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid behandelt, die eine erhöhte RPSA- und Phospho-FAK397-Expression zeigten (Abb. 4a – c). Als nächstes untersuchten wir, ob die durch RFGDT verbesserte Zelladhäsion über einen ähnlichen Mechanismus vermittelt werden könnte. Wir beobachteten einen starken Anstieg der Phospho-FAK397- und RPSA-Expression nach RFGDT durch Immunblotting (Abb. 4d, e) und Immunfluoreszenz (Abb. 4f, g). Diese Reaktionen wurden durch Vorbehandlung der Biomaterialoberfläche mit Silan oder durch Zugabe von NAC aufgehoben, was darauf hindeutet, dass diese Redox-vermittelt sind. Schließlich fragten wir, ob die verbesserte Zellbindung über den verstärkten Lamininrezeptor nach RFGDT das Überleben und die Proliferation der Zellen beeinflussen würde. Wir beobachteten eine signifikante Verbesserung (n = 3, p < 0,05) in der RGFDT-Gruppe im Vergleich zu allen anderen Gruppen (Abb. 4h). Diese Ergebnisse legen nahe, dass eine verbesserte Zelladhäsion nach RFGDT über die induzierte RPSA-Expression vermittelt werden könnte.

Durch RFGDT erzeugtes Redox induziert die RPSA-Expression. (a) Western Blots für RPSA und aktivierte FAK-Expression wurden nach Behandlungen mit Wasserstoffperoxid im Laufe der Zeit bewertet; (b) und (c) Bandquantifizierung der Western Blots wird gezeigt; (d) Eine ähnliche Analyse wurde nach RFGDT auf Glasoberflächen durchgeführt. Einige Proben wurden vor RFGDT und Zellaussaat mit ODS oder NAC vorbehandelt; (e) Bandenquantifizierung der Western Blots wird gezeigt; (f) Auf diesen Glasoberflächen wurde nach Vorbehandlungen oder RFGDT eine Immunfluoreszenz zur RPSA-Expression durchgeführt. (g) Quantifizierung in fünf Hochleistungsfeldern als Mittelwerte mit Standardabweichungen; (h) Glasoberflächen wurden Silan, Alkohol oder RFGDT ausgesetzt und mit MDPC-23-Zellen ausgesät. Die Zellzahlen wurden nach 24 Stunden mit dem AlamarBlue-Assay bestimmt. n = 3, *p < 0,05. RFGDT: Radiofrequenz-Glimmentladungsbehandlung; ODS: n-Octadecyltrichlorsilan; NAC: N-Acetylcystein; DAPI: 4′,6-Diamidino-2-phenylindol.

Biomaterialschnittstellen stellen eine wichtige Herausforderung für die Verbesserung der Funktionsintegration und die Bestimmung klinischer Therapieergebnisse dar36. Von einfachen biokompatiblen, inerten Grenzflächen bis hin zu bestehenden bioaktiven Oberflächen wurden erhebliche Fortschritte bei der Zusammensetzung und dem Design von Biomaterialien erzielt. Neuere Biomaterialsysteme konzentrieren sich auf intelligente Systeme, die in der Lage sind, biologische Szenarien zu erkennen und mit gezielten Reaktionen darauf zu reagieren. Ein wichtiges funktionelles Merkmal dieser Biomaterialschnittstellen besteht darin, wünschenswerte biologische Reaktionen zu fördern und gleichzeitig schädliche Reaktionen selektiv aktiv zu verhindern3. Einige der letztgenannten Reaktionen zielen darauf ab, die mikrobielle Belastung (Biofilm) zu verringern, um langwierige Entzündungen oder Immunreaktionen des Wirts zu verhindern37,38. Dies erleichtert routinemäßige Gewebeheilungsreaktionen und kann regenerative klinische Ergebnisse ermöglichen.

In dieser Studie wurden häufig vorkommende orale Mikroben und Zellen aus der Zahnpulpa verwendet, um die Auswirkungen von RFGDT auf Biomaterialien zu untersuchen, die routinemäßig in der klinischen Zahnheilkunde verwendet werden. Eine durch Karies verursachte Pulpaentzündung führt zu einer irreversiblen Nekrose, die endodontische Eingriffe und koronale Restaurationen erforderlich macht. Verschiedene Pulpaüberkappungsmittel wie Calciumhydroxid, Mineraltrioxidaggregat (MTA), Emdogain oder Glasionomerzement liefern Hinweise zur Förderung der Gewebeheilung (Osteodentin). Sie bekämpfen jedoch nicht direkt die Restinfektion, die zu einer langwierigen Entzündung führt. Strategien zur direkten Modifikation der Plasmaoberfläche erzeugen antibakterielle Eigenschaften durch Modulation der Oberflächentopographie oder -chemie39. Abgesehen davon, dass es als alternative Desinfektionstechnik dient, sind seine Auswirkungen auf die Verbesserung biokompatibler Schnittstellen gut dokumentiert. Diese herausragende Doppelwirkung von RFGDT, die in dieser Studie festgestellt wurde, nämlich die antimikrobielle Desinfektion und die Förderung der Zelladhäsion und -expansion, ist für den klinischen Einsatz besonders attraktiv (Abb. 5)40,41. Die antimikrobiellen Wirkungen von RFGDT, die vorwiegend auf Katalase-negative Mikroben abzielen, scheinen für gesunde klinische Szenarien, in denen aerobe Bakterien vorherrschen, direkt relevant zu sein. Die verringerte Wirksamkeit gegenüber Katalase-negativen Mikroben wurde in dieser Studie deutlich und konnte klinisch mit zusätzlichen Spülungen oder Medikamenten vor der Materialplatzierung behoben werden.

Überblick über die RFGDT-Antworten. Das Bild zeigt die doppelte Wirkung des durch RFGDT erzeugten Redoxes mit einer antimikrobiellen Wirkung auf Mundbakterien und der Induktion des Laminin-Adhäsionsrezeptors RPSA, der eine verbesserte Zellanhaftung und Expansion von Odontoblasten erleichtert.

In dieser Studie wurde festgestellt, dass die Entstehung von Redoxspezies auf Biomaterialoberflächen auf deren chemischer Zusammensetzung beruht. Während sowohl Glas als auch Platin Redox induzieren konnten, zeigte das Polymersubstrat (PMMA) eine minimale Induktion. Dies scheint das Ionisierungspotential der vorherrschenden Elementarbestandteile (Glas: Siliciumdioxid 786 kJ/mol und Platin 867 kJ/mol) widerzuspiegeln, die für zahnmedizinische Biomaterialien wie verstärkten Zement und Metallimplantate repräsentativ sind. Glas- oder metallverstärkte Zemente und Verbundwerkstoffe werden routinemäßig als Zahnersatzmaterialien verwendet. In einer früheren Studie wurde festgestellt, dass mit Kunststoffkompositen befestigte Dicor-Glasrestaurationen das klinische Überleben im Vergleich zu anderen Biomaterialien verbesserten42. Im Gegensatz zu Glas und diesen beiden Biomaterialien, die eng mit Zellen interagieren, wird das Polymermaterial (PMMA: 6857 kJ/mol) jedoch hauptsächlich zur Herstellung externer Prothesen verwendet, bei denen die desinfizierenden, nicht klebenden Eigenschaften von größter Bedeutung sind. Zukünftige Untersuchungen könnten die zellulären Reaktionen auf PMMA untersuchen, einschließlich Funktionalisierungsansätzen zur Verbesserung der zellulären Schnittstelle. Dennoch scheinen direkte Verbundmaterialien wie Pulpaverbände für die RFGDT-Technik ungeeignet zu sein.

Wir beobachteten eine optimale Behandlungszeit von drei Minuten zur Desinfektion und verbesserten Zelladhäsion mit RFGDT für Glasoberflächen unter Vakuum. Neben der Biomaterialzusammensetzung und der Behandlungszeit sind weitere Variablen, die diese Grenzflächenreaktionen bestimmen, die Gaszusammensetzung (wie Helium oder Argon) in der Kammer, die Energiedichte und das Vorhandensein anderer Spurenstoffe43,44. Die Berücksichtigung dieser Parameter kann die Entwicklung zukünftiger biomaterialspezifischer RFGDT-Protokolle ermöglichen. Es ist auch wichtig zu betonen, dass die RFGDT auf unbelebten Biomaterialoberflächen vor der Zellaussaat durchgeführt wurde, ohne dass sie Mikroben oder Zellen direkt ausgesetzt waren. Direkte Behandlungen mit nicht-thermischem Plasma an Säugetierzellen führen zu DNA-Schäden und zum Verlust der Lebensfähigkeit45. Dies impliziert im Wesentlichen, dass die direkte klinische RFGDT auf menschlichem Gewebe zur Desinfektion oder Verbesserung der Zellreaktionen eine unhaltbare Strategie ist. Nichtsdestotrotz könnten Oberflächenbehandlungen von Biomaterialgeräten diese auf optimale Gewebeinteraktionen wie die Osseointegration von Metallimplantaten, Glasionomeren oder metallverstärkten Verbundwerkstoffen als Zahnfüllungsmaterialien vorbereiten. Die letztgenannte Anwendung war einer der Hauptgründe für unsere Wahl der Präodontoblasten-Zelllinie MDPC-23. Interessanterweise haben wir in anderen Studien eine unterschiedliche Redoxempfindlichkeit zwischen Zellen diskreter Abstammung beobachtet46. Zukünftige Studien könnten die Selektivität von RFGDT an komplexen mehrteiligen Biomaterialsystemen mit spezifischen Zelltypen wie Osteoblasten (Osseointegration), Keratinozyten (Wundheilung), Fibroblasten (Matrixproduktion) oder Endothelzellen (Angiogenese) untersuchen, um gezielte klinische Ergebnisse zu erzielen. Diese Studie beobachtete RFGDT-erzeugte ROS, die mittels Chemilumineszenz nach der Oxidation von Luminol31 nachgewiesen wurden. Die Mengen und diskreten ROS spielen eine entscheidende Rolle für das Überleben, die Migration und die Apoptose der Zellen47,48. Redox ist ein physiologischer Regulator intrazellulärer Signalkaskaden, insbesondere Tyrosinkinase-vermittelter Wachstumsfaktoren, und hat aufgrund seiner Fähigkeit, redoxempfindliche Ziele reversibel zu oxidieren, in letzter Zeit Aufmerksamkeit erregt49. Diese reversiblen Redoxmodifikationen von Cysteinresten in Proteinen, auch Thiolschalter genannt, werden durch Oxidoreduktase und Thiol-Isomerasen reguliert50. Ihre Hauptfunktion besteht darin, überschüssiges Redox im biologischen System zu neutralisieren, das zu schädlichen Schäden führen kann. Zu den weiteren Zielen der redoxgenerierten Signalübertragung gehören eine breite Palette von Komponenten des Zytoskeletts, Signalzwischenprodukte und Transkriptionsregulatoren.

Ein wichtiges Ergebnis dieser Studie ist, dass RFGDT-induziertes Redox die Expression des Lamininrezeptors Ribosomal Protein SA (RPSA) fördert, der zu einer verbesserten Zelladhäsion und einem verbesserten Überleben beiträgt. Laminine sind extrazelluläre Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht, die den wichtigsten nicht-kollagenen Bestandteil der Basallamina in Zellen darstellen51,52. Ihre Multidomänenproteine werden von elf menschlichen Genen kodiert, die durch heterodimere α-, β- und γ-Ketten gekennzeichnet sind, die 16 verschiedene Isoformen darstellen. Ihre wichtigsten Beiträge zu zellulären Funktionen wie Adhäsion, Migration und Differenzierung sind gut beschrieben. Kürzlich wurden Erkenntnisse über die Rolle spezifischer Laminine bei der selektiven Zellanreicherung und Abstammungsspezifierung gewonnen, die erhebliche Auswirkungen auf die Gewebeheilung und -regeneration haben53. Neben den prototypischen Mitgliedern gibt es viele Proteine mit Laminin-ähnlichen Domänen, zu denen unter anderem RPSA, LamR, 37LRP und LBP/p40 gehören54. RPSA ist ein ribosomales Protein mit mehreren pathophysiologischen Funktionen in der Proteintranslation, Zelladhäsion, Tumorzellinvasion, viralem Zelleintritt und der Erkennung kleiner Moleküle55,56. Die Aminosäuresequenz ist evolutionär konserviert und weist eine Homologie von über 98 % bei allen Säugetieren sowie strukturelle Ähnlichkeiten mit dem prokaryotischen Gen RPS254 auf. Es wäre interessant, die funktionelle Bedeutung von RFGDT-induziertem RPS2 in der mikrobiellen Spezies in zukünftigen Studien zu untersuchen.

Es wurde festgestellt, dass RPSA an der cap-abhängigen eukaryotischen Translation beteiligt ist, insbesondere in transformierten und viral infizierten Zellen. Die Upstream-Induktion der RPSA-Signalübertragung muss jedoch noch vollständig geklärt werden. In einigen früheren Berichten wurde darauf hingewiesen, dass RPSA durch redoxgenerierte Signale induziert wird, was darauf hindeutet, dass es sich um ein redoxinduzierbares Zielgen handelt34,35. In Übereinstimmung mit diesen Berichten beschreibt diese Studie die Fähigkeit von RFGDT-induziertem Redox, die RPSA-Expression zu erhöhen. Die erhöhte Expression dieses Zelladhäsionsrezeptors würde zu einer verbesserten Anheftung und einem besseren Überleben der MDPC-23-Zellen beitragen. Es wurde festgestellt, dass die Membranclusterung dieser Lamininrezeptoren die Tyrosin-397-Phosphorylierung von FAK induziert, wie auch in dieser Studie festgestellt wurde. Sowohl die FAK- als auch die Src-Aktivierung an diesen Membranadhäsionskomplexen treiben zelluläre Funktionen wie Zellausbreitung, -migration, -proliferation und die Verhinderung von Apoptose weiter voran. Somit scheint die Verwendung von RFGDT diskrete redoxerzeugte biologische Reaktionen hervorzurufen, die sowohl für die Desinfektion als auch für zelluläre Funktionen wie Zellanheftung, -expansion und -differenzierung genutzt werden können, um die Geweberegeneration zu unterstützen.

Zusammenfassend zeigt diese Studie die Fähigkeit eines nicht-invasiven, gerichteten Energiewerkzeugs, RFGDT, gleichzeitig eine antimikrobielle Desinfektion und verbesserte gerichtete zelluläre Reaktionen über Redox-Signalisierung durchzuführen. Dies zeigt RFGDT als einfaches, kostengünstiges und praktisches Tischgerät für die klinische Anwendung zur Verbesserung der Gewebeheilung und der regenerativen Ergebnisse.

Zahnpulpazellen von Mäusen (MDPC-23, freundliche Spende von Dr. Jacques Nor und Tatiana Botero, Universität Michigan) wurden in DMEM (Glutamax, hoher Glucosegehalt) gehalten, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (zertifizierter Qualität) und 100 Einheiten ml −1 Penicillin und 100 µg mL−1 Streptomycin (alle von Thermo-Scientific, USA). Die Zellen wurden bei 37 °C in einer befeuchteten Kammer mit 5 % CO2 gezüchtet.

Deckglas (18 mm, 0,12–0,17 mm Dicke, Matsunami-Mikrodeckglas) wurde zunächst mit 10 % Reinigungsmittel (Sparkleen, Fisher Scientific, USA) gereinigt und 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt (Aristocrat Ultraschall, Healthco, USA), gefolgt von drei Wäschen in destilliertem Wasser einweichen und vertikal in einem Halter trocknen lassen. Anschließend wurden einige Deckgläser 10 Minuten lang in 95 % Ethanol (Sigma-Aldrich, USA) eingeweicht, während ein anderer Satz 10 Minuten lang in 2 % n-Octadecyltrichlorsilan (ODS) eingeweicht wurde. Schließlich wurde ein weiterer Satz Deckgläser der RFGDT unterzogen, wie unten beschrieben. Mit Ausnahme des RFGDT wurden alle Proben 15 Minuten vor der Zellaussaat unter UV-Licht sterilisiert.

Ein Teilluftvakuum-RFGD-Gerät (PDC-32G, Harrick Scientific, USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Die Biomaterialien (Glasdeckgläser, Platinplatten oder PMMA-Scheiben) wurden in die Kammer gegeben und für verschiedene Zeiträume behandelt, wie in den einzelnen Studien angegeben. Biomaterialproben wurden sofort für biochemische, mikrobiologische oder Zelladhäsions-/Überlebensstudien verwendet.

MDPC-23-Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen ml–1 auf die oben beschriebenen behandelten Glasoberflächen in einer 12-Well-Schale ausgesät. Die Lebensfähigkeit und Proliferation der Zellen wurde mit dem AlamarBlue-Assay gemäß den Anweisungen des Herstellers bewertet. Kurz gesagt, nach 24-stündiger Zellinkubation wurden 10 % (Vol./Vol.) AlamarBlue-Reagenz (Thermo Fisher Scientific, USA) zu den vollständigen Medien gegeben und 2 Stunden lang inkubiert. Replikate der konditionierten Medien aus jeder Vertiefung wurden in schwarze Vertiefungen übertragen und die Fluoreszenz wurde mit einem Plattenlesegerät (Victor3, Perkin Elmer, USA) bewertet.

MDPC-23-Zellen wurden mit einer Zelldichte von 1 × 105 Zellen ml–1 auf die oben beschriebenen behandelten Glasoberflächen in einer 12-Well-Schale ausgesät. Die Zelladhäsion wurde nach 5-stündiger Inkubation wie zuvor beschrieben beurteilt. Da auf allen Substratbedingungen äquivalente Zellen ausgesät wurden und innerhalb von 5 Stunden keine Proliferation zu erwarten ist, wurden die nicht anhaftenden, schwimmenden Zellen (höhere, zuverlässigere globale Zahlen) in jeder Bedingung gezählt, anstatt mehrere Hochleistungsfelder (niedriger, weniger) abzubilden zuverlässige lokale Zahlen) pro Bohrloch. Medien aus jeder Vertiefung wurden gesammelt, mit Trypanblau (0,4 % w/v, Sigma-Aldrich, USA) gefärbt und auf schwimmende (nicht ausgesäte) Zellen untersucht. Nach dem Ersetzen der Medien wurden die Platten einer Zentrifugation (Eppendorf, USA) bei 2400 U/min (schwache Adhäsionen) und 4000 U/min (starke Adhäsionen) für 6 Minuten unterzogen, und die Medien wurden gesammelt, um die Zellzahlen zu bestimmen. Von diesen Vertiefungen wurden auch vor und nach dem Zentrifugieren Bilder aufgenommen, um die Anzahl und Morphologie der adhärenten Zellpopulationen zu dokumentieren. In einigen Studien wurden Katalase (10 uM), N-Acetylcystein (1 mM) oder Wasserstoffperoxid (alle von Sigma-Aldrich, USA) vor der Zellbesiedlung der Glasoberflächen in die Medien einbezogen, um die Rolle von RFGDT zu bewerten -induzierte ROS bei der Vermittlung der Zelladhäsion.

Zur Beurteilung der durch RFGDT erzeugten ROS wurde ein Chemilumineszenztest mit Luminol (erkennt sowohl extra- als auch intrazelluläre ROS) wie zuvor beschrieben33 verwendet. Kurz gesagt wurde eine Lösung hergestellt, indem 5 mg Luminolpulver mit 100 ml 1 M Natriumhydroxid (beide Sigma-Aldrich, USA) gemischt und vorsichtig gemischt wurden. Die frisch zubereitete Luminollösung wurde den Zellen in einer Platte mit 12 Vertiefungen in einem Verhältnis von 1 ml/Vertiefung (Vol./Vol.) unmittelbar nach den RFGDT-Behandlungen in verschiedenen Dosen zugesetzt, und Chemilumineszenz wurde nach 0,5, 1, 3 und 5 Minuten nachgewiesen unter Verwendung eines Multiwell-Detektors (Victor3, Perkin Elmer, USA).

Glasdeckgläser wurden RFGDT-behandelt und mit MDPC23-Zellen ausgesät. Nach 5-stündiger Inkubation im CO2-Inkubator wurden die auf dem Deckglas befestigten Zellen aus verschiedenen Gruppen gesammelt und die gesammelten Zellen wurden in RIPA-Puffer (Sigma-Aldrich, USA) mit Mini-Protease-Inhibitor (Thermo Scientific, USA) resuspendiert. Die Zellen wurden mit zwei Ultraschallzyklen (QSonica, USA) für jeweils 5 s gestört und die Lysate wurden 20 min lang bei 4 °C und 14.000 U/min zentrifugiert. Das Gesamtprotein in den Lysaten wurde mit dem Bradford-Assay-Kit (BCA Protein Assay, Thermo Scientific Inc.) quantifiziert. Proteinlysate wurden in vorgefertigten fleckenfreien Mini-Protein-TGX-Gelen aufgetrennt und auf PVDF-Membranen (beide Bio-Rad, USA) übertragen. Die Blots wurden zunächst 1 Stunde lang mit 1 % BSA blockiert und anschließend über Nacht bei 4 °C mit Primärantikörpern für Ribosomal Protein SA (RPSA, Abcam, USA) oder Phospho-FAK (Cell Signaling, USA) inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Blots zur Normalisierung mit geeigneten artspezifischen HRP-konjugierten Sekundärantikörpern (Cell Signaling, USA) oder HRP-konjugiertem β-Actin (Cell Signaling, USA) inkubiert. Schließlich wurden die Blots unter Verwendung chemilumineszierender Substrate (Thermo Scientific, USA) entwickelt und die Bilder mit dem ChemiDoc MP Imaging System (Bio-Rad Laboratories, USA) digital gescannt. Die Intensitäten der Western-Blot-Proteinbanden wurden mithilfe der ImageJ-Software quantifiziert. In den unterstützenden Abbildungen sind mehrere Blot-Aufnahmen angegeben.

In allen Gruppen wurden Immunfluoreszenzexperimente unter Verwendung des primären Laminin-Antikörpers (RPSA) (Kat.-Nr. ab133645, Abcam, USA) und des sekundären Alexa-Fluor-488-Antikörpers (Kat.-Nr. 4412S, Cell Signaling, USA) durchgeführt. Die Bilder wurden mit ZOE Fluorescent Cell aufgenommen Imager (Bio-rad, USA), bei dem der Kern mit DAPI gegengefärbt wurde. Es wurden digitale Bilder aufgenommen und nach der Schwellenwertbestimmung wurde die Fluoreszenzintensität über das gesamte Feld mithilfe der NIH ImageJ-Software wie zuvor beschrieben quantifiziert57,58.

Fakultative Anaerobier wie Streptococcus-Mutanten (S. mutants), Streptococcus gordonii DL1 (S. Gordonni), Moraxella catarrhalis (M. catarrhalis) wurden in Gehirn-Herz-Infusionsmedium (BD Bioscience, USA) bei 37 °C gezüchtet und obligat anaerob Porphyromonas gingivalis ( P. gingivalis) wurde anaerob in Trypticase-Sojabrühe-Medium (BD Bioscience, USA), ergänzt mit 10 % Schafblut, Hämin (5 μg mL-1) und Menadion (1 μg mL-1), gezüchtet und bei 37 °C in einem Inkubator inkubiert Atmosphäre aus N2/H2/CO2 (90:5:5). Eine einzelne Kolonie jedes Bakteriums wurde zu 5 % oder 15 % H2O2 gegeben und qualitativ auf das Vorhandensein von antioxidativer Katalase analysiert. Für den Überlebenstest wurde eine 10 %ige 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchloridlösung (TTC, Sigma Aldrich, USA) in die Kulturvertiefungen gegeben und 6–12 Stunden lang oder bis ein roter Farbumschlag sichtbar wurde, inkubiert. Die Farbintensität wurde unter Verwendung eines Mikroplattenlesegeräts (SpectraMax i3x, Molecular Device, USA) bei 480 nm quantifiziert.

Für die CFU-Assays wurden Deckgläser mit jeweils 250 µL Bakterienkultur beimpft und unter artspezifischen Wachstumsbedingungen 24 Stunden (S. gordonni, M. catarrhalis, S. mutants) bzw. 5 Tage (P. gingivalis) inkubiert. Aliquots der Bakterienkultur von Glasdeckgläsern wurden seriell durch zehnfache Verdünnungen verdünnt und mit der Tropfplattentechnik ausplattiert.

Die Daten wurden mit Excel (Microsoft, USA) analysiert und die statistische Signifikanz entweder mithilfe einer einfaktoriellen ANOVA oder eines t-Tests bewertet, wobei p < 0,05 als statistisch signifikant galt. Alle Studien wurden mindestens zweimal wiederholt, wobei jeder Test in minimalen Duplikaten durchgeführt wurde.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel und seinen ergänzenden Informationsdateien enthalten. Weitere Informationen oder Materialien sind jedoch auf begründete Anfrage bei den Autoren erhältlich.

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Diese Arbeit wurde durch ein Faculty Start-up Grant (PRA) unterstützt. Dieses Manuskript ist dem Andenken an Dr. Robert E. Baier gewidmet.

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Sasikumar Ponnusamy und Hanan H. Ali.

Robert E. Baier ist verstorben.

Abteilung für Oralbiologie, Chirurgie und Biomedizintechnik, Universität Buffalo, 3435 Main Street, B36A Foster Hall, Buffalo, NY, 14214, USA

Sasikumar Ponnusamy, Hanan H. Ali, Felisha Dutt, Saeed Ur Rahman, Ahmad A. Salah, Mahek Pipalia und Praveen R. Arany

Abteilung für Biomaterialien, Universität Buffalo, Buffalo, NY, USA

Robert E. Baier

Oralbiologie, Institut für medizinische Grundlagenwissenschaften, Khyber Medical University, Peshawar, 25000, Pakistan

Saeed Ur Rahman

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SP und HA führten Studien durch und bereiteten den ersten Entwurf des Manuskripts vor, FD, SR, MP und AS halfen bei verschiedenen Studien und der Datenerfassung; RB lieferte Beiträge zum ersten Studiendesign und PA überwachte das Projekt und überarbeitete das Manuskript.

Korrespondenz mit Praveen R. Arany.

Die Autoren geben an, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Ponnusamy, S., Ali, HH, Dutt, F. et al. Redox-Signale induzieren die Expression des ribosomalen Proteins SA des Lamininrezeptors, um die Zelladhäsion nach Hochfrequenz-Glimmentladungsbehandlungen zu verbessern. Sci Rep 12, 7742 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-11766-9

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Eingegangen: 19. Januar 2022

Angenommen: 20. April 2022

Veröffentlicht: 11. Mai 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-11766-9

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